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玉米丝氨酸羧肽酶基因(ZmSCP)的克隆及功能分析
中文名称: 玉米丝氨酸羧肽酶基因(ZmSCP)的克隆及功能分析
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论文编号: 4143147收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Cloning and Functional Analysis of Serine Carboxypetidases Gene from Zea Mays L.
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 生物化学与分子生物学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 丝氨酸羧肽酶 基因克隆 表达模式 遗传转化 功能分析
简介目录: 点击此处 免费索取本论文简介和目录>>
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论文摘要: 植物在其长期进化过程中常受到一些病原微生物的侵袭;植物和病原微生物在生态系统中长期并存,相互影响,乃至协同进化.在这一过程中植物逐渐形成了一系列防御机制来保护自己(略)应是一个非常复杂的过程,涉及到多种调控防卫反应,包括对病原微生物的识别、信号传导途径中的信号传导、抗病反应基因的调控和表达等.丝氨酸羧肽酶(serine carboxypeptidases, SCP)基因和丝(略)蛋白(serine carboxypeptidase(略), SCPL)在植物伤应答反应、油菜素内酯等合成途径中起着重要作用.本研究以玉米高耐纹枯病自交系R15和烟草W38为实验材料,利用电子克隆、RACE技术从R15中克隆了玉米丝氨酸羧肽酶基因;利用半定量RT-PCR和Real-time PCR对目的基因表达模式进行分析;利用原核表达系统表达大量(略)体外抑菌特性分析.同时,构建过量表达载体转化烟草初步探讨基因的生物学功能,主要研究结果如下: ⒈结合电子克隆、RT-PCR技术和RACE技术对与丝氨酸羧肽酶基因同源的EST序(略)结果显示,该基因全长为1874 bp(GenBank登录号:JF6...
Plants were often invased by some pathogen(omitted)ganisms through the long-term evolution, and they co-exis(omitted)ng time, interact each other and even the co-evolution in ecosystem. Plants gradually form a se(omitted)ant defense mechanisms to protect themselves. Plant disease resistance is (omitted)plex process and involved in a variety of regulation and defense responses, including the identification of pathogens, signal transduction,(omitted)lation and expression of disease resistance and so on. ...
目录:
摘要第4-7页
Abstract第7-9页
第1章 文献综述第18-46页
  ·植物对逆境胁迫的响应第19-35页
    ·植物对生物胁迫的响应第19-29页
      ·植物抗病基因第20-22页
      ·植物抗病相关基因第22-26页
      ·植物抗病信号传导途径第26-29页
    ·植物对非生物胁迫的响应第29-32页
      ·内源性保护物质第30-31页
      ·植物对非生物胁迫应答的信号传导途径第31-32页
    ·逆境胁迫相关转录因子第32-35页
      ·bZIP转录因子第33页
      ·MYB转录因子第33页
      ·DREB转录因子第33-34页
      ·NAC转录因子第34页
      ·WRKY转录因子第34-35页
  ·丝氨酸羧肽酶基因研究进展第35-39页
    ·丝氨酸羧肽酶结构与分布第35-37页
    ·氨酸羧肽酶分类第37页
    ·丝氨酸羧肽酶类蛋白第37-38页
    ·丝氨酸羧肽酶及其类蛋白的功能第38-39页
  ·基因功能研究方法第39-42页
    ·原核表达系统第39-40页
    ·酵母表达系统第40-41页
    ·基因的遗传转化第41-42页
    ·RNA沉默第42页
  ·本研究目的、意义及研究路线第42-46页
    ·本研究目的及意义第42-43页
    ·本研究内容及总体路线第43-46页
第2章 材料与方法第46-76页
  ·试验材料第46-51页
    ·供试材料第46页
    ·病原菌第46页
    ·酶、菌株与载体第46-48页
    ·培养基及常用溶液第48-50页
    ·试剂盒与试剂第50页
    ·主要仪器第50-51页
  ·试验方法第51-76页
    ·植物材料的培育及处理第51页
    ·病原菌培养及其接种方法第51-52页
    ·ZmSCP基因的克隆与鉴定第52-59页
      ·总RNA的提取、检测及cDNA第一链合成第52-53页
      ·ZmSCP基因的电子克隆第53页
      ·引物设计第53页
      ·中间片段的RT-PCR分析第53-54页
      ·目的片段克隆测序第54-56页
        ·目的片段回收第54页
        ·感受态细胞的制备(CaCl_2法)第54-55页
        ·连接反应第55页
        ·热击法进行转化第55页
        ·阳性克隆的鉴定第55-56页
      ·RACE(5'RACE和3'RACE)第56-57页
        ·RACE cDNA模板合成第56-57页
        ·RACE-PCR第57页
        ·目的片段克隆及测序第57页
      ·cDNA全长的获得第57页
      ·生物信息学分析第57-58页
      ·ZmSCP基因在玉米中拷贝数分析第58-59页
        ·米材料DNA提取第58页
        ·探针的制备第58-59页
        ·Southern blot第59页
    ·ZmSCP基因表达模式分析第59-61页
      ·米材料的准备及处理第59-60页
      ·半定量RT-PCR与荧光定量PCR第60-61页
        ·引物设计第60页
        ·总RNA提取和cDNA第一链合成第60页
        ·实时荧光定量PCR引物的特异性检测第60页
        ·定量标准品的制备第60页
        ·FQ-PCR反应及结果分析第60页
        ·半定量RT-PCR第60-61页
    ·ZmSCP基因的原核表达及体外抑菌特性分析第61-67页
      ·ZmSCP基因ORF的分离第61页
      ·原核表达载体的构建第61-63页
      ·ZmSCP基因在大肠杆菌中的诱导表达第63-64页
        ·最佳诱导时间的分析第63-64页
        ·最佳诱导剂浓度分析第64页
        ·最佳诱导温度分析第64页
      ·表达产物的SDS-PAGE分析第64-65页
      ·融合蛋白的Western blot检测第65-66页
      ·目的蛋白对立枯丝核菌抑菌特性分析第66-67页
        ·目的蛋白的纯化第67页
        ·目的蛋白体外抑菌特性分析第67页
    ·ZmSCP基因的转基因研究第67-76页
      ·植物材料准备第67页
      ·过量表达载体构建第67-69页
        ·ZmSCP基因ORF的分离第67-68页
        ·酶切及连接第68-69页
      ·农杆菌转化第69-70页
        ·农杆菌感受态细胞的制备第69-70页
        ·冻融法转化农杆菌第70页
        ·转化子的PCR检测第70页
      ·农杆菌转化烟草第70-71页
      ·转基因阳性植株的筛选第71-72页
        ·烟草基因组DNA、RNA、蛋白质的提取第71页
        ·转基因阳性植株的分子检测第71-72页
      ·转基因烟草植株中防卫相关基因的表达分析第72-73页
      ·ZmSCP转基因烟草生长状况调查第73页
      ·ZmSCP转基因烟草植株抗病性鉴定第73-75页
        ·烟草赤星病病原菌处理第73-74页
        ·烟草青枯病病原菌处理第74页
        ·米纹枯病病原菌处理第74-75页
      ·ZmSCP转基因烟草植株叶片抗盐性测定第75页
      ·ZmSCP转基因烟草种子抗旱性分析第75页
      ·ZmSCP转基因烟草植株抗氧化性分析第75-76页
第3章 结果与分析第76-122页
  ·ZmSCP基因全长cDNA序列的克隆与序列分析第76-89页
    ·丝氨酸羧肽酶基因的电子克隆第76页
    ·玉米总RNA的提取和鉴定第76-77页
    ·ZmSCP基因全长cDNA序列的克隆第77页
    ·ZmSCP基因的生物信息学分析第77-87页
      ·ZmSCP基因编码的氨基酸及其在基因组中分布情况第77-80页
      ·不同植物的SCP基因编码的氨基酸同源性及进化树分析第80-82页
      ·丝氨酸羧肽酶的氨基酸组成分析第82-83页
      ·氨酸羧肽酶蛋白质的修饰位点预测第83-84页
      ·氨酸羧肽酶蛋白质信号肽的预测第84-85页
      ·丝氨酸羧肽酶蛋白质亚细胞定位结果预测第85-86页
      ·丝氨酸羧肽酶保守结构域分析第86-87页
    ·ZmSCP基因的拷贝数分析第87-89页
      ·探针效率检测第87-88页
      ·Southern杂交第88-89页
  ·ZmSCP基因表达模式分析第89-96页
    ·引物的特异性检测第89-90页
    ·荧光定量扩增效率检测第90-91页
    ·ZmSCP基因在逆境胁迫下的表达模式分析第91-96页
      ·ZmSCP基因在立枯丝核菌胁迫下的表达模式分析第91-92页
      ·ZmSCP基因在ABA胁迫下的表达模式分析第92-93页
      ·ZmSCP基因在JA胁迫下的表达模式分析第93-94页
      ·ZmSCP基因在低温胁迫下的表达模式分析第94-95页
      ·ZmSCP基因在盐胁迫胁迫下的表达模式分析第95-96页
  ·ZmSCP基因的原核表达及体外抑菌特性分析第96-102页
    ·ZmSCP基因开放阅读框的分离第96-97页
    ·重组表达质粒pET32a(+)-ZmSCP的构建第97-99页
    ·pET32a(+)-ZmSCP在大肠杆菌中的诱导表达第99-100页
    ·表达产物Western blot检测第100页
    ·目的蛋白体外抑菌特性分析第100-102页
      ·目的蛋白纯化第100-101页
      ·目的蛋白体外抑菌特性分析第101-102页
  ·ZmSCP基因的转化实验第102-122页
    ·ZmSCP基因开放阅读框的分离第103页
    ·植物双元表达载体pCAMBIA1301-ZmSCP的构建第103-105页
    ·ZmSCP转基因烟草植株的获得第105-107页
    ·ZmSCP转基因烟草植株的检测第107-110页
      ·转基因烟草的PCR检测第107-108页
      ·转基因烟草的RT-PCR检测第108-109页
      ·转基因烟草表达蛋白检测第109-110页
    ·转基因烟草植株中防卫相关基因的表达分析第110-111页
    ·ZmSCP转基因烟草生长状况调查第111-112页
    ·ZmSCP转基因烟草植株抗病性鉴定第112-116页
      ·烟草赤星病病原菌处理第112-114页
      ·烟草青枯病病原菌处理第114页
      ·米纹枯病病原菌立枯丝核菌胁迫处理第114-116页
    ·ZmSCP转基因烟草植株叶片抗盐性测定第116-118页
    ·ZmSCP转基因烟草种子抗旱性分析第118-119页
    ·ZmSCP转基因烟草抗氧化分析第119-122页
第4章 讨论第122-130页
  ·玉米ZmSCP基因的克隆第122-123页
  ·ZmSCP基因在玉米基因组中拷贝数分析第123页
  ·玉米ZmSCP基因对逆境胁迫的响应第123-124页
  ·玉米ZmSCP基因表达产物的抑菌特性分析第124-126页
    ·表达载体的选择及诱导体系优化第124-125页
    ·表达产物纯化第125-126页
    ·融合蛋白作用研究及应用前景第126页
  ·转ZmSCP基因烟草与植物逆境胁迫第126-130页
    ·转ZmSCP基因烟草启动植物防卫系统第126-127页
    ·玉米ZmSCP基因提高转基因烟草的抗病性第127页
    ·玉米ZmSCP基因提高转基因植株的耐盐性第127-128页
    ·转ZmSCP基因烟草种子抗旱性提高第128页
    ·玉米ZmSCP基因与转基因植株的抗氧化性有关第128-129页
    ·玉米ZmSCP基因在抗病育种中的价值第129-130页
第5章 总结与展望第130-134页
  ·结论第130-132页
  ·正在开展和拟开展的研究第132-133页
  ·展望第133-134页
参考文献第134-152页
致谢第152-156页
攻读学位期间发表文章第156-157页
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