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人类胚胎干细胞无饲养细胞体系建立及初步研究
中文名称: 人类胚胎干细胞无饲养细胞体系建立及初步研究
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论文编号: 4142829收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: The Establishment of Feeder-free Human Embryonic Stem Cells Culture System and Primary Researches
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 医学遗传学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 人类胚胎干细胞 克隆密度 自分泌 碱性成纤维细胞生长因子 信号通路
简介目录: 点击此处 免费索取本论文简介和目录>>
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论文摘要: 人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)来源于植入前人类囊胚的内细胞团(inner cell mass, ICM)(略)多向分化潜能和无限自我复制能力的特定细胞类型,为临床细胞替代治疗和人类胚胎发育机制研究等提供了理想的材料.目前,制约hESCs研究的一个重要的因素就是hESCs培养体系,目前普遍采用的是饲养细胞培养体系,饲养细胞培养(略)要强度很到的劳动量和不稳定性,生产的hESCs细胞产量远不能够满足临床和实验研究的需要,建立简单稳定的无饲养细胞培养体系成为迫切的要求,同时无饲养细胞培养体系有助于阐明(略)持未分化状态的机制,也是hESCs定向诱导分化的基础,也可以消除hESCs |临床应用必需考虑动物源(略)在的危险性.本研究的主要内容是建立一种无饲养细胞hESCs体外培养体系,并对该无饲养细胞培养体系进行了初步研究. 本论文第一章的研究内容是建立了一种新的hESCs无饲养细胞培养体系(称之为NB体系),对该培养体系下培养的hESCs鉴定结果显示,(略)hESCs和有饲养细胞培养体系下hESCs一样维持了自身的未分化状态,表...
hESCs derived from inner(omitted) (ICM) of blastula before implantation possesses pluri-potential and unlimited self-renew capacity, providing (omitted)el for human embryo development research and ideal materials for clinic cell replacement therapy. At present, it is the cell cul(omitted)m that is an obstacle of hESCs researches, the production of hESCs in feeder cu(omitted)em can not meet the requirement of clinic and basal research, owing t(omitted)tension and hard scale, at the same time, the mechan...
目录:
摘要第4-8页
ABSTRACT第8-11页
专业名词缩写中英文对照表第16-17页
前言第17-20页
实验技术路线第20-21页
第1章 无饲养细胞人类胚胎干细胞体外培养体系的建立第21-49页
  ·材料第22-23页
    ·细胞系第22页
    ·试剂第22-23页
    ·主要的仪器设备第23页
  ·方法第23-32页
    ·人类成纤维饲养细胞制备第23-24页
    ·NB体系培养皿包被处理第24页
    ·FGF2生长因子配制第24页
    ·HEF体系下hESCs传代培养第24页
    ·NB体系下hESCs传代培养第24-25页
    ·未分化克隆百分比第25页
    ·hESCs AKP染色第25页
    ·hESCs分子标记免疫细胞化学染色第25-26页
    ·hESCs RNA抽提第26-27页
    ·RNA纯化处理第27页
    ·逆转录RT-PCR步骤第27-28页
    ·多能性基因半定量PCR检测第28页
    ·NB培养体系下hESCs对早期神经发育关键转录因子Pax6和Sox1表达检测第28页
    ·hESCs染色体检测第28-29页
    ·畸胎瘤形成实验第29页
    ·hESCs细胞表面标记物TRA-1-60和SSEA-4流式分析第29-30页
    ·hESCs冷冻保存第30-31页
    ·hESCs解冻培养第31-32页
  ·结果第32-36页
    ·NB体系下培养的hESCs为未分化状态的hESCs第32-34页
      ·NB体系hESCs表现出典型的未分化hESCs外观形态第32-33页
      ·NB体系下hESCs表达多能性基因第33页
      ·NB体系下hESCs不表达早期神经发育关键转录因子第33-34页
      ·NB体系下hESCs表达未分化hESCs细胞表面标记物第34页
      ·NB体系下长期培养的hESCs保持了正常的染色体核型第34页
      ·NB体系下hESCs体内多向分化潜能检测第34页
    ·hESCs冷冻和解冻培养第34-35页
    ·HEF体系下和NB体系下hESCs TRA-1-60和SSEA-4流式分析第35-36页
  ·讨论第36-38页
  ·小结第38-39页
  ·附图第39-49页
第2章 有饲养细胞和无饲养细胞培养体系下人类胚胎干细胞比较第49-81页
  ·材料第49-50页
    ·细胞系第49页
    ·试剂第49页
    ·主要的仪器设备第49-50页
  ·方法第50-54页
    ·HEF体系下和NB体系下hESCs对Rex1,Gbx2和FGF5基因的表达第50页
    ·HEF体系下hESCs细胞倍增时间检测第50页
    ·NB体系下hESCs细胞倍增时间检测第50-51页
    ·细胞周期检测第51-52页
    ·细胞凋亡检测第52页
    ·HEF体系和NB体系来源的hESCs经EBs自发分化倾向检测第52-53页
    ·NB体系下hESCs转回HEF体系后经EBs自发分化倾向检测第53页
    ·NB体系下hESCs转回HEF体系后TRA-1-60和SSEA4流式分析第53页
    ·HEF体系和NB体系下hESCs形成畸胎瘤评级分析第53-54页
  ·结果第54-62页
    ·hESCs对Rex1,Gbx2和FGF5基因表达第54页
    ·hESCs克隆形态第54-55页
    ·HEF体系和NB体系下hESCs细胞倍增时间第55-56页
    ·细胞凋亡和细胞周期第56页
    ·hESCs体外多向分化潜能检测第56-60页
    ·NB体系下hESCs转回到HEF体系后FACS分析第60-61页
    ·畸胎瘤分化倾向分析第61-62页
  ·讨论第62-66页
    ·HEF和NB体系下hESCs仍处于胚胎发育的内细胞团阶段第62页
    ·HEF体系和NB体系下hESCs克隆形态第62-63页
    ·NB体系比HEF体系能更加有效扩增hESCs第63-64页
    ·不同培养体系可影响hESCs分化倾向第64-66页
  ·结论第66-67页
  ·创新点第67-68页
  ·附图第68-81页
第3章 hESCs自分泌维持自身未分化状态第81-100页
  ·材料第81-82页
    ·细胞系第81-82页
    ·试剂第82页
    ·主要的仪器设备第82页
  ·方法第82-85页
    ·hESCs对Wnts、FGFs、TGFs信号通路家族成员部分配体基因表达第82页
    ·HEF体系和NB培养体系BMP样诱导活性检测第82-83页
    ·NB体系来源的hESCs无FGF2细胞因子培养第83页
    ·无FGF2细胞因子NB体系下hESCs克隆种植密度对维持未分化状态的影响第83页
    ·无FGF2细胞因子NB体系下hESCs鉴定第83-84页
    ·NB培养体系下,hESCs条件培养基细胞因子测定第84-85页
  ·结果第85-88页
    ·Wnt、TGFbeta和FGF信号通路部分配体基因表达半定量分析第85页
    ·NB体系存在较低的BMP样诱导活性,hESCs克隆种植密度可改变该种BMP样诱导活性第85-87页
    ·NB体系下hESCs未分化状态的维持不需要外源性的FGF2第87页
    ·NB体系下hESCs条件培养基细胞因子测定第87-88页
  ·讨论第88-90页
  ·小结第90-91页
  ·创新点第91-92页
  ·附图第92-100页
参考文献第100-103页
综述第103-109页
  参考文献第107-109页
致谢第109-110页
攻读学位期间发表的主要论文第110-111页
个人简介第111页
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