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基因工程菌pTrcHis2A-hTNF-α-JM109生产人肿瘤坏死因子α的研究
中文名称: 基因工程菌pTrcHis2A-hTNF-α-JM109生产人肿瘤坏死因子α的研究
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论文编号: 3688447收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Studies on Production of Human Tumor Necrosis Factor-α by Gene Engineering Bacteria-pTrcHis2A-hTNF-α-JM109
学位类型: 硕士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 生物化学与分子生物学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: hTNF-α 克隆 纯化
简介目录: 点击此处 免费索取本论文简介和目录>>
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论文摘要: 用PCR方法从含人肿瘤坏死因子α(hTNF-α)基因的pM3(略)中扩增出hTNF-α的cDNA序列,用限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ酶切消化PCR产物后插入到经过相同内切酶酶切的大肠杆菌表达载体pTrcHis2A质粒,构建成pTrcHis2A-hTNF-α重组表达质粒.经过鉴定后,将重组质粒命名(略) 将PTH质粒转化宿主大肠杆菌,构建基因工程菌hTNF-α-pTrcHis2A-JM109,加入IPTG作为诱导物,诱导hTNF-α基因表达.SDS-PAGE检测表达产物的分子量,得到一条分子量约为20kd的区带,与融合蛋白的分(略)融合蛋白α-末端的6个串联组氨酸作为检测标记,用辣根过氧化物酶标记的抗C-末端组氨酸抗体进行western-blotting实验,结果为阳性(略)外源基因hTNF-α在大肠杆菌中得到表达;用表达的hTNF-α进行体外细胞毒实验,比活性为1.47×10_3U/mg,证实表达的hTN(略)物学活性. 采用不同浓度的IPTG和诱导时间,诱导基因工程菌hTNF-α-pTrcHis2A-JM109表达hTNF-α,确定I...
The cDNA sequence of hTNF-α ( human tumor (omitted)actor) was enriched by PCR from the plasmid pM3 which contains the gene of hTNF-α . The recombinant expression plasmid (omitted)TrcHis2A was constructed by the insertion of hTNF-α gene into endonuclease BamHI, HindII(omitted)E.coli expression vector pTrcHis2A .The reco(omitted)asmid was identified and named for PTH. The PTH plasmids were transformed into host E. coli JM109 to construct gene engineering bacteria pTrcHis2A- hTNF(omitted) The transform...
目录:
摘要第6-9页
  中文摘要第6-7页
  英文摘要第7页
一 前言第9-15页
  (一) TNF的发现第9页
  (二) 人肿瘤坏死因子的基因结构和蛋白质分子结构第9-10页
  (三) TNF基因的表达和调控第10-11页
  (四) TNF的制备方法第11页
  (五) hTNF-α的生物功能和作用机制第11-13页
  (六) TNF的检测方法第13-14页
  (七) TNF的应用第14-15页
二 材料和方法第15-29页
  (一) 主要仪器第15页
  (二) 实验材料第15-18页
    ·质粒和菌种第15-16页
    ·细胞株第16页
    ·主要试剂第16页
    ·其他试剂第16-18页
  (三) 技术路线第18-20页
  (四) 实验方法第20-29页
    ·碱裂解法抽提质粒DNA第20页
    ·质粒DNA的乙醇法浓缩第20-21页
    ·引物设计和PCR扩增第21页
    ·质粒DNA的限制性内切酶酶切第21页
    ·质粒酶切产物的去磷酸化处理第21-22页
    ·DNA连接反应第22页
    ·大肠杆菌感受态细胞的制备第22页
    ·重组DNA的转化第22-23页
    ·重组质粒的鉴定第23页
    ·外源基因在大肠杆菌中的诱导表达第23-25页
    ·western-blotting实验第25-27页
    ·表达产物的体外细胞毒实验第27页
    ·表达产物的纯化第27-29页
三 结果与分析第29-40页
  (一) pTrcHis2A-hTNF-α表达质粒的构建与鉴定第29-33页
    ·表达载体的选择第29页
    ·pTrcHis2A质粒的鉴定第29-30页
    ·hTNF-α基因cDNA的PCR扩增第30-31页
    ·重组基因的构建和鉴定第31-33页
      ·重组基因的构建第31页
      ·重组基因的鉴定第31-33页
  (二) 重组基因表达产物的鉴定第33-35页
    ·SDS-PAGE测定表达产物的分子量第33页
    ·western-blotting实验第33-34页
    ·体外细胞毒实验第34-35页
  (三) 基因工程菌hTNF-α的生产和纯化第35-40页
    ·hTNF-α的制备第35-37页
      ·hTNF-α的诱导表达第35-36页
        ·IPTG的浓度对表达的影响第35页
        ·诱导时间对表达的影响第35-36页
      ·不同宿主菌对重组蛋白表达的影响第36-37页
    ·表达产物的纯化第37-40页
      ·离子交换层析第37-38页
      ·亲和层析第38-40页
四 讨论第40-46页
五 结论与展望第46-47页
六 附录第47-58页
  (一) 略词中英文对照第47-48页
  (二) 参考文献第48-53页
  (三) hTNF-α的基因序列第53-56页
  (四) hTNF-α的基因序列第56-58页
  (五) 在学期间发表的论文和致谢第58页
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