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菌寄生真菌粉红聚端孢生防机制的研究
中文名称: 菌寄生真菌粉红聚端孢生防机制的研究
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论文编号: 3102318收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Studies on Biocontrol Mechanisms of the Mycoparasite Agent Trichothecium Roseum
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 植物病理学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 粉红聚端孢菌 菌寄生真菌 几丁质酶 基因克隆 TCN毒素 生防机制 生物防治
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论文简介:菌寄生真菌是以真菌为寄主,从其中获取营养物质,并相应的导致寄主真菌的消亡或崩解的一大类真菌。在理论上,菌寄生真菌是研究机体互作等生命科学的重要材料;在应用上,菌寄生真菌是生物防治实践中的重要保障。在生物防治越来越受人们青睐的今天,菌寄生真菌的分离和研究对拓展生物防治因子、解析生防机制具有重要的理论和现实意义。 利用从小麦散黑穗病株上分离到的散生于散黑穗病菌的一株粉红聚端孢菌为试材,研究了粉红聚端孢菌对供试植物病原菌的菌寄生特性。利用光学和电子扫描显微镜观察技术,对在载玻片PDA上共培养的两种菌,进行重寄生作用观察,发现粉红聚端孢菌不仅能够缠绕、穿透寄主菌丝,而且能够致使病原菌菌丝消解、细胞变形,表现明显的菌寄生特性。研究还对粉红聚端胞的发酵液进行了抗菌特性的初步分析,结果发现,发酵液(原始)对棉花黄萎病菌具有显著的抗菌作用。 几丁质酶是重寄生过程菌寄生真菌产生的重要和代表性胞外水解酶之一,分离、纯化粉红聚端孢菌(Trichothccium roseum)胞外几丁质酶,以及制备几丁质酶抗体是研究其重寄生机制的重要前提。在以几丁质为碳源的综合培养基中接种粉红聚端孢菌,10d后收集培养滤液,并经(NH<,4>)<,2>SO<,4>分级沉淀、DEAE-sepharose FF阴离子交换柱层析和CM-Sepharose FF阳离子交换柱层析等几个纯化步骤,最后获得了电泳纯的胞外几丁质酶。几丁质酶分子量约为39 kDa,等电点为5.16,最适作用温度为40℃,最适pH范围为4.0-7.0。纯酶对供试病原菌都有不同程度的抑菌作用,其中对棉花黄萎菌的抑制作用最强。此外,以纯化的几丁质酶为抗原,对兔子进行了免疫注射,经免疫杂交检测,最后获得了稀释5000倍可检测到0.05ng抗原的抗血清。 几丁质酶对病原真菌细胞壁的降解和破坏作用是菌寄生真菌抗菌机制的重要原因之一。具有显著抗菌特性的粉红聚端孢作为一种重要的菌寄生真菌,其几丁质酶的作用是不容忽视的。通过对菌寄生真菌几丁质酶同源序列分析,利用PCR技术获得了编码380个氨基酸、分子量为41.6kDa的几丁质酶基因cDNA,基因组Southern分析表明该基因以单拷贝形式存在。融合几丁质酶在大肠杆菌中得到成功表达,且可通过一步色谱法得到纯化。等电聚焦分析表明融合蛋白的等电点为pH 5.4;融合几丁质酶具有中等热稳特点;在40℃、pH4.0-7.0条件下表现最高几丁质酶活性。融合几丁质酶与来源于红粉聚端孢的几丁质酶具有较为相似的特征,特别是在抑制病原真菌的孢子萌发和生长方面,说明它们可能是同一种几丁质酶。 Trichothecenes是具有潜在抑制真核生物蛋白质合成功能的毒素,多由丝状真菌(filamentous fungi)代谢产生。利用菌寄生真菌粉红聚端孢菌为材料,在其它培养条件一致的前提下,分别采用有无几丁质作为碳源的两种SM培养基培养粉红聚端孢菌。10天后收集培养滤液并经滤纸过滤、氯仿∶异丙醇(1∶1)抽提、Kieselgel 60硅胶柱层析、Reverse-HPLC和制备型TLC展层分离,获得了0.11mg和0.04mgTrichothecin(TEN)毒素,其中以几丁质为主要碳源所得毒素的相对含量明显大于前者的相对含量。TLC-BIOASSAY抗菌试验证实,该毒素能有效抑制病原真菌的生长。
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