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以VEGFR-2为靶点的口服DNA疫苗抗小鼠Lewis肺癌生长和转移的实验研究
中文名称: 以VEGFR-2为靶点的口服DNA疫苗抗小鼠Lewis肺癌生长和转移的实验研究
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论文编号: 3102308收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: An Oral DNA Vaccine Targeting VEGFR-2 Inhibits Murine Lewis Lung Cancer Growth and Metastasis
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 胸心外科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: Lewis肺癌 VEGFR-2 生长和转移 SL3261 DNA疫苗 免疫治疗 免疫耐受
简介目录: 点击此处 免费索取本论文简介和目录>>
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论文简介:目的:本研究以减毒沙门氏菌SL3261为载体制备口服VEGFR-2 DNA疫苗,分别对C57BL/6小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型、原位肺癌模型和肺转移癌模型进行免疫治疗,研究其抗肺癌生长和转移的效果及其可能的作用机制。 方法: 1.采用RT-PCR技术,克隆C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-2胞外区cDNA片段,构建重组质粒pcDNA3.1-VR-2,脂质体介导转染COS-7细胞,Western blotting检测其蛋白表达。 2.将pcDNA3.1-VR-2转化减毒沙门氏菌SL3261,制备DNA疫苗,免疫C57BL/6小鼠,ELISA法检测免疫后小鼠外周血VEGFR-2抗体水平、MTT法检测小鼠脾淋巴细胞对小鼠血管内皮细胞MSl的体外杀伤活性,研究疫苗的生物学活性。将携带质粒pEGFP-C2的SL3261经口服免疫C57BL/6小鼠,流式细胞术检测脾脏和小肠中GFP的表达,观察SI3261在体内的分布情况。 3.将小鼠随机分为疫苗组、空质粒组和生理盐水组,经口服免疫C57BL/6小鼠三次后,建立肺癌皮下移植瘤模型,比较各组小鼠的累计生存率;比较各组小鼠在体肿瘤生长情况和离体肿瘤体积、肿瘤湿重;比较各组小鼠外周血CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>T淋巴细胞水平,评价小鼠免疫功能;免疫组织化学法计数离体肿瘤微血管密度(MVD),观察疫苗对小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤生长的抑制作用,探讨可能的作用机制。 4.将小鼠随机分为疫苗组、空质粒组和生理盐水组,经口服免疫C57BL/6小鼠三次后,建立原位肺癌模型,比较各组小鼠的累计生存率;体视学方法计数肺脏肿瘤转移病灶,肺组织病理切片HE染色鉴定转移病灶,观察疫苗对C57BL/6小鼠原位Lewis肺癌转移的抑制作用。 5.将小鼠随机分为疫苗组、空质粒组和生理盐水组,经口服免疫C57BL/6小鼠三次后,尾静脉注射3LL细胞建立肺转移癌模型,采用流式细胞术监测各组小岛次后,尾静脉注射3LL细胞建立肺转移癌模型,采用流式细胞术监测各组小岛}外周血细胞CD44v值;体视学方法计数肺脏肿瘤转移病灶,肺组织病理切片HE染色鉴定转移病灶,观察疫苗抑制小鼠肺转移癌的情况并探讨可能的作用机制。 6. 统计学分析:数据处理用SPSS1O.O统计软件包。计量资料比较用方差分析,计数资料比较用x。检验,生存率的比较Kaplan-Meier法。 结果: 1.克隆了C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-2胞外区cDNA片段,并构建了重组质粒pcDNA3.1-vR-2,Western b10tting证实目的基因可在COS-7细胞中表达。 2.成功制备了以减毒沙门氏菌SI,3261为载体的VEGFR-2 DNA疫苗。经ELISA法检测结果显示:疫苗组小鼠在免疫两周后产生了高水平血清抗VEGFR-2 IgG类抗体,抗体滴度随着免疫时间和免疫次数的增加而增高,明显高于生理盐水组和质粒对照组,差异均有统计学意义(尺O.05),而空质粒组和生理盐水组比较,差异无统计学意义(乃0.05);MTT法检测结果显示:疫苗组淋巴细胞对靶细胞MSl的杀伤率随着效靶比的增加而增加,其脾淋巴细胞CTL活性明显高于生理盐水组和空质粒对照组,差异有统计学意义(尺0.05),而空质粒组和生理盐水组比较,差异无统计学意义(乃0.05)。流式细胞术(FCM)检测结果显示:首次口服免疫C57BL/6小鼠一周后,携带质粒pEGFP—C2的减毒沙门氏菌SI,3261在小鼠的脾脏和小肠均有GFP表达。 3.建立了L,ewis肺癌皮下移植瘤模型、原位肺癌模型和肺转移癌模型。 4.疫苗抑制小鼠Lewi s肺癌皮下移植瘤生长作用的研究结果: 1)疫苗组的在体肿瘤生长、离体肿瘤体积、肿瘤重量、微血管密度与空质粒组或生理盐水组比较,差异有统计学意义(F0.05),而空质粒组和生理盐水组比较,差异无统计学意义(p>0.05); 2)流式细胞术检测结果显示:免疫前三组之间CD3<'+>、 CD4<'+>、CD8<'+>T细胞计数,CD4<'+>/CD8<'+>比值均无显著性差异(p>0.05),免疫后疫苗组CD3’、CD4<'+>、CD8<'+>T细胞较免疫前明显增高(P<0.05),和空质粒组、生理盐水组比较差异有统计学意义(P<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>。T细胞计数,CD4<'+>/CD8<'+>比值明显降低(P<0.05),和疫苗组比较差异有统计学意义(P<0.05)。 3)疫苗组小鼠的累计生存率与空质粒组、生理盐水组比较有统计学差异(p,O.05)。 5.疫苗抑制Lewis原位肺癌的作用研究结果; 6.疫苗组小鼠种植侧肺内肿瘤体积较小,未发现明显对侧转移,而空质粒组和生理盐水组小鼠种植侧肺内肿瘤体积较大,对侧肺脏均出现转移灶,病理组织切片证实和种植侧为相同组织学类型; 7.疫苗组原位种植对侧肺内瘤结节数目明显低于生理盐水组和空质粒组,差异有统计学意义(P(O.05)。生理盐水组和空质粒组之间差异无统计学意义(P>0.05)。 8.疫苗抑制Lewis肺转移癌研究结果: 1)流式细胞术显示:空质粒组和生理盐水组外周血CD44v阳性细胞计数明显高于疫苗组,差异有统计学意义(P<0.05)。生理盐水组和空质粒组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。 2)体视学分析显示:疫苗组的瘤结节数目明显低于生理盐水组和空质粒组,差异有统计学意义(P0.05)。 结论: 1.成功克隆了C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-2胞外区cDNA片段,构建了重组质粒 pcDNA3.1-VR-2,目的基因可以在COS-7中表达。 2.成功制备了以SL3261为载体的VEGFR-2 DNA疫苗,该疫苗可激活特异性的细胞免疫和体液免疫。 3.该DNA疫苗能通过抑制肺癌血管生成而抑制小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤、原位肺癌及肺转移癌的生长和转移。 4.该口服DNA疫苗的作用机制,一方面可能是通过激活体液免疫机制,封闭VEGF/VEGFR一2信号转导通路,抑制肿瘤血管内皮细胞增值;另一方面可能是通过打破机体对自身抗原的免疫耐受而激活细胞免疫,杀伤过表达VEGFR-2的肿瘤血管内皮细胞,抑制肿瘤血管生成,进而抑制肺癌生长和转移。
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