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嗜热真菌热稳定纤维素酶的分离纯化及基因的克隆与表达
中文名称: 嗜热真菌热稳定纤维素酶的分离纯化及基因的克隆与表达
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论文编号: 3102248收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Purification, Characterization, Gene Cloning and Expression of Thermostable Cellulases from Thermophilic Fungi
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 植物病理学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 嗜热毛壳菌CT2 埃默森篮状菌 热稳定纤维素酶 纯化 cDNA克隆 DNA克隆 嗜热真菌
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论文简介:纤维素是地球上最丰富的碳水化合物质,可被纤维素酶降解转化成为葡萄糖。具有很好的开发前景。纤维素酶因其在多领域潜在的应用价值而倍受关注,它可用于纤维废物的生物转化,也可用于纺织、造纸、洗涤、饲料加工等工业领域,还可用于加工单细胞蛋白,制备酵母和丝状真菌的原生质体,进行菌株改良。传统上采用化学方法控制纤维素降解难度大、成本高,对环境污染严重,而纤维素的生物降解有效克服了这些问题,不但提高了资源利用效率,而且增加了经济效益。 纤维素能被千百种真菌、细菌和放线菌等微生物所降解,生物降解过程很重要的一组酶是纤维素酶。外切葡聚糖纤维二糖水解酶(1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase或exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91)是其中必不可少的一类酶。在水解纤维素过程中,外切葡聚糖纤维二糖水解酶主要作用于纤维素线性分子非还原末端,水解β-1,4-糖苷键,每次切下一个纤维二糖分子,使结晶纤维素成为易溶解的非结晶纤维素。β-葡聚糖苷酶(β-1,4-glucosidase,EC3.2.1.21,简称BG)也是纤维素酶系的重要组成成分,这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子防止纤维二糖的积聚,减轻其对纤维素酶的抑制作用,因此该酶对于纤维素酶系的整体水解活性有很强的促进作用。 嗜热真菌产生的纤维素酶在高温条件下具有高活力和稳定性,并且与中温真菌一样,嗜热真菌产生的各类纤维素酶普遍含有多种类型的组分。到目前为止,外切葡聚糖纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶在真菌上的研究仍多以中温真菌为主,嗜热真菌(Thermophlic fungi)上的研究很少。本实验室分离的嗜热毛壳菌(Chaetomiumthermophilum CT2)和埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)是广泛分布的,生长上限温度较高的两种嗜热真菌,从这两种菌中均已分离了多种嗜热纤维素酶,主要是内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。本研究在发酵过程中检测到外切葡聚糖纤维二糖水解酶的活性,说明嗜热毛壳菌和埃默森篮状菌是纤维素酶系较齐全的两种嗜热真菌。本研究中C.thermophilum CT2在以微晶纤维素为唯一碳源的合成培养基中液体诱导发酵产生胞外纤维素酶,通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子层析、Septlacryl S-100分子筛层析、DEAE-Sepharose Fast Flow强阴离子层析等步骤获得了两种凝胶电泳均一的外切葡聚糖纤维二糖水解酶和一种口服葡萄糖苷酶,同时对该两种酶的多项理化性质进行研究。SDS—PAGE测得所分离纯化外切葡聚糖纤维二糖水解酶蛋白的分子量约为66.3kDa和180.3kDa。该两种酶反应的最适温度分别为65℃-170℃。反应的最适pH值分别为5.0和4.0。在60℃以下两种酶均比较稳定,在70℃保温1h后酶活性仍维持在60%左右,在80℃T保温20minCBH I具有20%的活性,在90℃T保温20minCBH II仍具有近10%的活性。相比较而言,具有比CBH I更高的热稳定性。这两种酶热稳定性较中温真菌的同类酶高。这两种酶在pH4.0—7.0之间均比较稳定,说明外切葡聚糖纤维二糖水解酶I和II具有一定的耐酸性。以pNPC为底物CBH I的Km值为0.956mmol/L。纯化的肛葡萄糖苷酶为单亚基蛋白,相对分子量在118.0kDa-120.1kDa,其反应的最适温度为70℃,反应的最适pH值在4.0—5.0之间。从zemersonii相同培养条件下的发酵液中也分离两种外切葡聚糖纤维二糖水解酶,其中CBHI和CBHII的分子量约为70.0kDa和72.2kDa。其最适反应温度分别为55℃和60℃,最适反应pH值为6.0和3.0。在60℃及60*(2以下时CBHI和CBHII酶基本都是稳定的,在70'c时保温1h后,CBHII的剩余酶活还能保持在70%左右,其热稳定性较好。CBHI酶在pH5.0—8.0之间较为稳定,CBHII在pH3.0—7.0之间的范围内比较稳定,该酶较之CBHI具有很强的耐酸性。以pNPC为底物,CBHI的Km值为0.936mmol/L,CBHII的‰为0.917mmol/L。根据真菌外切葡聚糖纤维二糖水解酶的氨基酸同源保守序列设计简并引物,通过RT-PCR及快速扩增cDNA末端(RACE)的方法,克隆了嗜热毛壳菌CthermophilumCT2热稳定纤维二糖水解酶cbh3基因,cDNA序列全长为1356bp,包含一个开放阅读框,编码451个氨基酸。该基因已在Genbank中注册,登录号为DQ085790。同时提取嗜热毛壳菌CthermophilumCT2基因组DNA,克隆了该外切酶的部分DNA序列,获得的序列长1507bp,包含三个内含子区域。该基因在GenBank中注册号为EF222284。将cbh3基因与酵母表达载体pPIC9K经EcoRI和NotI双酶切后,体外连接构建了酵母分泌型表达载体pPIC9K/cbh3,将重组表达质粒pPIC9K/cbh3和pPIC9K空质粒分别用限制性内切酶SacI(位于5'AOXl区内)线性化后,采用电击法转化巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris GSll5感受态细胞,于MD/MM平板上筛选His’Mut+表型的酵母转化子。经过PCR检测及G418抗性筛选多拷贝整合子,进行甲醇诱导培养。通过检测各转化子每隔24h的蛋白表达情况来筛选高效表达目的纤维二糖水解酶的工程菌株。经过枪测与筛选获得了转酵母:二程菌株,检测目的蛋白的表达量及遗传稳定性,并测定表达纤维二糖水解酶CBH的酶学性质。本研究以嗜热真菌为研究对象,纯化了五种新的纤维素酶,分离了一个新的纤维素酶基因,并率先尝试进行真核表达,成功构建了能高效表达目的蛋白的转酵母工程菌株。以上开展的相关研究为纤维素酶的结构与功能的研究提供了现实依据,同时也为纤维素酶的工业化生产奠定了理论基础。
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