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嗜热毛壳菌热稳定蛋白酶的纯化、基因克隆与表达
中文名称: 嗜热毛壳菌热稳定蛋白酶的纯化、基因克隆与表达
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论文编号: 3102231收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Purification, Cloning and Expression of Thermostable Protease from Chaetomium Thermophilum
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 植物病理学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 嗜热毛壳菌 热稳定蛋白酶 纯化 基因克隆 热稳定性 丝氨酸蛋白酶 基因
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论文简介:蛋白水解酶催化蛋白质中肽链的裂解,是一类在生理学和商业领域中具有广泛应用价值的酶。蛋白酶执行大量的不同的生理功能,负责包括在正常和非正常状态下复杂的病理、生理功能。它们也存在于致病生物体的生活史中,这就使它们成为一个潜在的发展治疗因子的对象,来治愈如癌症和艾滋病等可怕疾病。蛋白酶在食品和清洁剂工业中的应用具有悠久的历史。微生物来源的蛋白酶,由于具有培养简便,产量丰富等特点,适于工业化生产而得以广泛应用。其中,热稳定性蛋白酶的研究和开发具有重要的商业价值。 嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)是一种广泛分布的,生长上限温度较高的嗜热真菌,从该菌中已分离了多种嗜热酶,但未见该菌嗜热蛋白酶的报道。本研究中C.thermophilum在以酪蛋白为唯一碳源的合成培养基中诱导产生了蛋白酶,通过硫酸铵沉淀、DEAE-Seplaarose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了两种凝胶电泳均一的蛋白酶。SDS-PAGE测得所分离纯化酶蛋白的分子量分别约为33kD和63kDa。两种酶都可以被PMSF所抑制,但不能被iodoacetamide和EDTA抑制。PR033和PR063的最适反应pH分别为10.0和5.0。两种酶的最适反应温度均为65℃,在60℃以下较稳定,Ca<'2+>对酶的的热稳定性具有显著的增强作用。 根据真菌热稳定蛋白酶的同源保守序列设计兼并引物,通过RT-PCR及快速扩增cDNA末端(RACE)的方法,克隆了该蛋白酶的编码基因pro,全长cDNA为2007bp,包含一个由532个氨基酸组成的开放阅读框。该基因已在Genbank中注册,登录号为DQ839520,DNA序列的登陆号为EF100880。 由核苷酸序列推导的相应氨基酸序列前15个氨基酸为信号肽序列,比较蛋白酶的催化区序列,发现与丝氨酸蛋白酶S8家族的枯草杆菌蛋白酶subtilisin的同源性很高,在催化区中有两个基序GHGTHV和GTSMASPH非常保守。这些保守基序与丝氨酸蛋白酶家族催化活性有关。 将经EcoR I和Not I双酶切的pro基因和原核表达载体pET_22b(+)进行连接,构建成原核表达载体pET/pro,并转化大肠杆菌E. coli BL21。经IPTG诱导培养4~5h,目的蛋白得到大量表达,SDS-PAGE电泳检测,在约41kDa处有一条明显的蛋白带,蛋白大小与从该蛋白酶氮基酸序列估汁的蛋白分子量相符;而空质粒pET-22b(+)转化BL21经诱导培养后无相应蛋白产生。可溶性分析结果显示,表达的蛋白以包涵体形式存在。 pro基因和酵母分泌型表达载体pPIC9K双酶切后体外连接,构建酵母重组表达载体pPIC9K/pro并测序,保证正确的阅读框。将重组表达质粒pPIC9K/pro和pPIC9K空质粒分别用限制性内切酶Sac I(位于5’AOX1区内)线性化后,采用电击法转化pichiapastoris GSll5酵母感受态细胞,于MD/MM平板上筛选His<'+>Mut<'+>表型的酵母转化子。经过PCR检测及G418抗性筛选多拷贝整合子,进行甲醇诱导培养。通过检测各转化子每隔24h的蛋白表达情况来筛选高效表达目的蛋白酶的工程菌株。筛选到表达酶活性最高的菌株GS-PRO-16,甲醇诱导6d酶活性达到最高,达16.73 U/mL,酶蛋白表达量为0.77 mg/mL。检测目的蛋白的表达量及遗传稳定性,并测定表达蛋白酶的酶学性质。 酵母工程菌株GS-PRO-16在YPD平板上划线,连续传代10次后,PCR检测呈阳性,重组蛋白酶的表达量基本保持稳定。表达蛋白酶PRO的最适反应温度和pH分别为60℃和8.0,该酶在60℃以下稳定;70℃的半衰期为60min;在pH值为5.0~12.0之间表达蛋白酶保持稳定的酶活性。 C.thermophilum蛋白酶能在毕赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白,而且表达产物同样具有原始菌株C. thermophilum蛋白酶的优良特性,这就预示了表达蛋白酶在工业和生物学领域的广阔应用前景。因此,期望能对该基因进行改造,或进一步优化表达条件,获得真正有工业应用价值的酵母工程菌株。
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