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禽呼肠孤病毒野毒株σC基因、抗原性及致病性比较研究
中文名称: 禽呼肠孤病毒野毒株σC基因、抗原性及致病性比较研究
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论文编号: 3102229收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Comparisons of Avian Reoviruse Field Strains for Their σC Gene Sequences, Antigenicity and Pathogenicity
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 预防兽医学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 禽呼肠孤病毒(ARV) 致病性 σC基因 抗原性 核酸探针 禽呼肠孤病毒 野毒株
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论文简介:呼肠孤病毒(reovirus)是呼吸道肠道孤儿病毒(respiratory enteric orphan virus)的简称,可分为两个主要的群,即哺乳动物来源呼肠孤病毒(MRV)和禽类来源呼肠孤病毒(ARV)。ARV属于呼肠孤病毒科中的正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus genus)。ARV可引起多种疾病,常见的有病毒性关节炎/腱鞘炎、吸收障碍综合征(MAS)、免疫抑制等。据报道ARV不同分离株的致病性差异很大,血清型多达10个以上。虽然ARV在我国鸡群中感染甚为普遍,但对.ARV分离株的致病性和抗原性方面很少有系统的研究报道。为了阐明ARV感染对我国养鸡业的确切危害及其流行病学,本文对不同地区、表现不同临床症状的不同类型的鸡群分离到的ARV的抗原性关系、部分基因核酸序列和对鸡的致病性作了比较研究。 1、10株ARV野毒株的分离、鉴定和纯化为了研究我国禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)流行毒株的致病性、抗原性及与抗原蛋白σC基因之间的关系,利用细胞培养方法从山东、北京、大连、新疆、吉林、江苏等不同省市患关节炎或(和)生长不良的鸡场分离到10株ARV。并以间接荧光抗体试验和RT-PCR扩增及序列分析的方法鉴定验证为禽呼肠孤病毒。其中7株来自患关节炎病鸡,分别为DL、DF、LC、CHX、NT、LY、XJ株;两株来自生长不良的肉鸡,为ZZ、CC株;一株来自关节炎和生长不良同时存在的种鸡,为YT株。上述病毒经CEF传代适应后,经无限稀释法连续纯化三次,以此纯化的病毒作为致病性和抗原性比较研究的病毒株。 2、不同分离株ARV σC基因序列与抗原性比较据报道,σC蛋白是ARV的抗原性蛋白。在本研究中,设计一对引物,用RT-PCR法扩增CHX、LY、CC、DL、LC分离株中编码σC蛋白的S1基因片断,并克隆测序,结果显示,这些ARV分离株编码σC蛋白基因片段的同源性均在99%以上,其中CC、CHX和LY株的σC基因100%同源。 用经纯化的ARV分离株分别用SPF鸡制备单因子血清,采用固定病毒稀释血清的方法在不同的毒株间进行血清中和反应,并计算相关系数r值。结果显示,ZZ、CC、CHX、LY、NT、XJ、S1133(疫苗株)的同源性均在25~74%之间,说明这些国内不同区域分离的ARV野毒株虽然仍属同一血清型,但抗原性已出现很大的差异。 从ARV野毒株σC基因片断测序结果和病毒交叉中和试验结果比较表明,ARV血清中和反应的抗原性并非仅仅与σC蛋白有关,有可能存在其它结构蛋白与该病毒的免疫保护性有关。 3、不同ARV株对SPF来航鸡致病性比较研究 4、LY株.ARV对IBDV强毒致病性和疫苗免疫后抗体反应的影响为进一步研究ARV的致病性及与其它病毒相互间的作用,本研究选用LY株ARV进行了进一步的研究。LY株ARV经皮下注射感染1日龄SPF。来航鸡,10<'5>TCID<,50>/只。结果显示,LY株感染对SPF鸡增重及7日龄AIV和NDV疫苗免疫后抗体滴度没有显著影响,但可引起法氏囊萎缩和淋巴细胞减少。LY株ARV感染1日龄SPF鸡后,30、52日龄时再分别用强毒株IBDV(GX株)攻击。结果显示,于30日龄攻击IBDV强毒后,1日龄感染LY株ARV的试验组死亡率为20.8%(5/24),显著低于未感染ARV仅攻击IBDV强毒对照组的58.3%(14/24):于52日龄时,攻击IBDV后,LY株ARV感染组死亡率为56.5%(13/23),仅攻击强毒IBDV的对照组为62.5%(15/24),差异已经不显著。这表明,随着日龄的增长,ARV感染引起的损伤有所恢复。ARV对强毒株IBDV的这种致病性减低的影响可能由于ARV感染导致IBDV的靶细胞受损,影响了IBDV的繁殖所致。 用LY株ARV感染1日龄SPF鸡,经IBDV弱毒疫苗免疫后,诱发的抗体滴度为2303±1310,显著低于对照组的3288±1451(P<0.01);但对随后IBDV强毒株攻毒的保护率却与对照鸡无显著差异。经IBDV弱毒疫苗免疫后,产生的抗体足以保护强毒株IBDV攻击,不会引起死亡,但强毒攻击仍能显著抑制AIV、NDV疫苗免疫后的抗体滴度。然而,对于1~7日龄经ARV感染的鸡,IBDV强毒的这种免疫抑制作用又显著低于未经ARV感染的对照鸡,表明ARV感染可影响其他疾病的致病性。ARV感染与IBDV共感染的这种复杂性,极有可能是由于ARV感染对IBDV的靶细胞淋巴滤泡的损伤所致。 5、ARV对肉鸡的致病性研究 6、用地高辛标记的核酸探针检测ARV在鸡群中的传播用地高辛标记禽呼肠孤病毒(ARV)S1基因中编码aC蛋白的基因片段作为核酸探针,用以检测组织中的ARV。核酸探针的敏感性和特异性结果显示,该核酸探针特异性强,可检测到1-6 pg的探针DNA。 利用所标记的核酸探针,检测了实验室感染CHX株ARV的鸡羽毛囊及体内不同组织病毒繁殖分布动态。结果显示,ARV感染1日龄SPF鸡,在24h时在大部分器官,如法氏囊、关节、脾脏、肝脏、肺脏、胸腺等器官中均能检测到ARV。在4日龄时,在未接种ARV但同群饲养鸡的相应器官中亦检测到ARV。试验结果还显示,在羽毛囊中的病毒检出率与鸡内脏器官中病毒的检出率一致。这表明检测羽毛囊中ARV可用于监测ARV在鸡群的流行状态。用核酸探针检测鸡羽毛囊中ARV的方法检测ARV的感染与流行情况,便于检测大量样品中的抗原,而且取样不影响生产,具有实际应用价值。 7.结语本研究在国内首次对ARV的不同野毒株的σC基因、致病性和抗原性作了系统的比较研究。从我国不同地区不同病例分离到的ARV,在单独人工感染时,均不易引起典型的临床病理变化。不同野毒株的σC基因相对保守,但不同野毒株在致病性程度和抗原性上仍有很大的差异。试验还证明,用核酸探针作分子杂交从羽毛囊中检测ARV在鸡群中的感染状态,是一种比较经济实用的方法。
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