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哈维氏弧菌外膜蛋白(OmpK和GAPDH)免疫原性研究及主要海水病原弧菌外膜蛋白交叉保护性抗原筛选
中文名称: 哈维氏弧菌外膜蛋白(OmpK和GAPDH)免疫原性研究及主要海水病原弧菌外膜蛋白交叉保护性抗原筛选
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论文编号: 3102198收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Study on the Immunogenicity of Vibrio Harveyi Outer Membrane Protein (OmpK and GAPDH) and Screening of Cross Protective Immunogens of Outer Membrane Protein from Several Main Marine Pathogenetic Vibrios
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 生物医学工程
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 哈维氏弧菌 副溶血弧菌 溶藻弧菌 外膜蛋白 OmpK 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) 大黄鱼 免疫蛋白质组学 亚单位疫苗
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论文简介:海洋弧菌是海水环境中普遍存在的一种革兰氏阴性细菌,其中某些种类是大黄鱼等海水养殖动物细菌性溃疡病的主要病原菌。鉴于滥用抗生素所造成的药物残留、细菌耐药性等不良后果,大黄鱼弧菌病的防治不得不从以化学药物治疗为主转向免疫预防。近年来,革兰氏阴性细菌外膜蛋白作为潜在的保护性抗原已越来越引起人们的重视。本研究从患病大黄鱼上分离得到三种常见病原菌:哈维氏弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌,以哈维氏弧菌为主,克隆并表达了两个外膜蛋白基因,研究了它们作为亚单位疫苗的免疫原性。利用免疫蛋白质组学方法结合基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,鉴定了三种弧菌具有交叉免疫反应性的外膜蛋白成分,探索开发基因工程多价疫苗的可能性。 哈维氏弧菌ompK基因含有一个804bp的开放读码框(ORF),编码由267个氨基酸组成的外膜蛋白OmpK,预测的分子量约为29KDa,pI为6.764。序列测定结果用BLAST软件搜索比对,和已登录的哈维氏弧菌外膜蛋白基因ompK的同源性高达99%,该基因在GenBank登录号为DQ279075:哈维氏弧菌gapdh基因含有一个996bp的开放读码框(ORF),编码由331个氨基酸组成的三磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH,预测的分子量约为35KDa,pI为5.187。BLAST软件搜索比对发现多种不同弧菌的gapdh是高度保守的,它们的核苷酸同源性在91%以上。该基因在GenBank登录号为DQl84650。 用LipoP软件分析可知ompK基因N端存在一个由20个氨基酸组成的信号肽,但gapdh基因没有发现信号肽序列,其到达细胞外膜的机制尚不明确。将ompK基因的信号肽序列去除经重叠延伸基因拼接扩增(SOE-PCR)和gapdv9基因融合成ompK-gapdh,分别构建原核表达载体pET-30a-ompK,pET-30a-gapdh和DET-30a-ompK-gapdh,在E.cohBL21中成功大量表达。重组OmpK和GAPDH经Ni-NTA亲和层析柱纯化后免疫新西兰兔,产生的多克隆抗体不仅能够分别跟各自的免疫原发生免疫反应,而且能够和提取的天然外膜蛋白产生免疫印迹,表明重组蛋白和天然外膜蛋白具有相似的免疫原性。新鲜培养的哈维氏弧菌能够分别被兔抗r-OmpK和兔抗r-GAPDH抗血清凝集,证明OmpK和GAPDH位于细胞表面。 根据同源建模原理模拟了哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK、GAPDH.的三维结构。外膜蛋白OmpK是由12个反向平行的B折叠经6个表面环和5个外周回折连成的桶状结构,以单体形式穿过细胞外膜形成通道;三磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH只是两个结构域经一短链连接而成,每个结构域各包含9个反向平行的β折叠和6个α螺旋。提取自哈维氏弧菌的天然外膜蛋白沸水浴中加热一段时间后经SDS-PAGE,分别和兔抗r-OmpK和兔抗r-GAPDH抗血清反应。由于加热使得孔蛋白的构像发生改变,包括β桶状二级结构的丧失等,兔抗r-OmpK血清反应中出现了两条反应带,表明OmpK类似于OmpA家族,具有热修饰性。而兔抗r-GAPDH血清只出现一条带,说明GAPDH无热修饰性。 将r-OmpK-GAPDH,r-OmpK,r-GAPDH及二者的混合物分别免疫大黄鱼,采集血清,ELISA检测抗体效价,尽管免疫组和对照组差别显著(p<0.05),但抗体效价不是很高,表明体液免疫在外膜蛋白引起的抗病过程中作用有限。分离试验大黄鱼的巨噬细胞,测定其对啤酒酵母的吞噬百分率和吞噬指数。统计结果表明巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数不仅免疫组和对照组差别显著(p<0.05),免疫组内r-OmpK-GAPDH和其他各组的差异也很明显(p<0.05),意味着细胞免疫在外膜蛋白的免疫保护中具有重要作用。各试验组大黄鱼用500×LD<,60>的哈维氏弧菌感染,各免疫组的相对成活率r-OmpK(37.7%),r-GAPDH(40.0%)及二者的混合物(41.9%),r-OmpK-GAPDH(69.1%)都显著高于对照组,其中r-OmpK-GAPDH(69.1%)最高,说明OmpK和GAPDH具有一定的免疫原性,二者融合后显示出明显的协同作用,可以作为亚单位疫苗的候选成分。 从患病大黄鱼中分离的8株病菌,经常规生理生化方法和以HSP60基因部分序列为基础的分子生物学方法鉴定为三种病原弧菌:哈维氏弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌。SDS-PAGE和Western-blots结果显示三种弧菌的外膜蛋白和哈维氏弧菌全菌多抗反应分别在45kDa,35kDa和22 kDa处出现三条大致相同的免疫条带,提示它们有可能是三种弧菌的交叉保护性抗原。利用免疫蛋白质组学方法结合基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,鉴定出哈维氏弧菌与副溶血弧菌和溶藻弧菌具有交叉反应性的部分外膜蛋白分别是副溶血弧菌麦芽糖孔蛋白和溶藻弧菌的一种功能未知的孔蛋白。以这些蛋白为目标抗原制备基因工程疫苗,可望能够同时抵抗不同种弧菌的感染,在基因工程多价疫苗的开发方面具有重要意义。
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