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抗病小麦中与大麦黄矮病毒CP蛋白和RdRp复制酶相互作用蛋白的研究
中文名称: 抗病小麦中与大麦黄矮病毒CP蛋白和RdRp复制酶相互作用蛋白的研究
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论文编号: 3102147收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Study on the Proteins Interacting with BYDV-CP and RdRp in BYDV Resistant Wheat Line
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 作物遗传育种
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 小麦 大麦黄矮病毒 外壳蛋白 RNA复制酶 相互作用蛋白 抗病 复制酶
简介目录: 点击此处 免费索取本论文简介和目录>>
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论文简介:黄矮病是由大麦黄矮病毒(barley yellow dwarf virus,BYDV)引起的小麦重要病毒病.本研究组已将源于中间偃麦草的抗黄矮病基因整合到小麦基因组中,创建了一系列抗黄矮病小麦一中间偃麦草易位系,如HW642,可抑制BYDV的复制与运动.为明确抗黄矮病小麦易位系中哪些蛋白与BYDV致病相关蛋白相互作用,本研究利用酵母双杂交系统,从HW642的cDNA文库中分离出与BYDV外壳蛋白(coat proitein,CP)和复制酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)相互作用的蛋白,对其进行结构预测和表达分析,取得以下结果.1.利用含有酵母转录因子GAL4 DNA结合域(DNA binding domain,BD)的载体pGBKT7,构建了BYDV-GAV的CP和RdRp全长基因的酵母双杂诱饵载体pGBKT7-CP和pGBKT7-RdRD,并转化酵母细胞进行表达分析.结果表明,pGBKT7-CP和pGBKT7-RdRp所表达的融合蛋白对酵母细胞没有毒害作用,且自身没有激活性,可作为酵母双杂系统的诱饵载体.2.利用SMART(swi tching mechanism At 5'end of the RNA transcript)技术构建抗黄矮病易位系HW642的酵母双杂交cDNA文库.该文库包含80万个转化子,均含有酵母转录因子GAL4的转录激活域(activation domain,AD),重组率达88﹪,插入片段大小为0.2-1.4kb,滴度为3×10<'7>CFU/ml.3.利用酵母双杂交系统,以pGBKT7-CP为诱饵,筛选HW642的酵母双杂交cDNA文库.两次筛库,分别获得155个和144个候选阳性克隆.通过两轮高严谨度的筛选,从第二次筛库所得候选阳性克隆中,鉴定出一个能够在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trip培养基上生长,与CP相互作用的克隆WY65,其插入片段编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Serine/Threonine kinase,STK)部分序列,将该基因命名为TaSTK1.进一步的β-半乳糖苷酶活性定量分析和载体互换实验证实,酵母中表达的TaSTK1融合蛋白与大麦黄矮病毒外壳蛋白间相互作用是特异的.采用巢式PCR策略和5'RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术,从HW642中分离出TaSTK1基因全长cDNA序列.4.推测的TaSTK1蛋白由460个氨基酸组成,其N端含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的保守结构域.在小麦中尚未发现与之同源的蛋白.二级结构预测显示,TasTKl蛋白由21个α螺旋,19个β链和29个拐角组成.PROSITE软件分析结果显示,TaSTK1具有2个与ATP结合的结构和1个质子受体相关活性位点.利用SWISS-MODEL预测了TaSTK1蛋白的高级结构.上述结果表明,TaSTK1是具有活性功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶.5.利用实时定量PCR对TaSTK1基因的表达情况进行分析,发现大麦黄矮病毒侵染抗病小麦易位系HW642后,能够提高TaSTK1基因的表达量,与此相反,大麦黄矮病毒侵染感病小麦后则抑制该基因的表达,表明TaSTK1在抗黄矮病反应中具有重要作用.6.利用酵母双杂交系统,以pGBKT7-RdRp为诱饵,筛选酵母双杂交cDNA文库,从同一个克隆里分离出2个质粒,分别命名为P500和P350,P500编码生长素应答因子(auxin.response factors,ARF)类蛋白的部分序列,P350编码1个未知蛋白.P500、P350和pGBKT7-RdRp三者个共同转化酵母能激活报告基因的表达,三者可能以"防卫假说"模式发生相互作用.
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