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牛结核病DNA疫苗的研究
中文名称: 牛结核病DNA疫苗的研究
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论文编号: 3102146收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Study on the DNA Vaccine Against Bovine Tuberculosis
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 预防兽医学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 牛结核病 DNA疫苗 免疫保护效果 牛分枝杆菌 疫苗免疫 免疫组 融合基因
简介目录: 点击此处 免费索取本论文简介和目录>>
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论文简介:牛结核病是主要由牛分枝杆菌引起的一种慢性消耗性疾病,在许多国家尤其是发展中国家仍广泛流行,该病不仅给畜牧业造成巨大的经济损失,而且严重威胁着人类的身心健康.因此,控制牛结核病对防治人类结核病意义重大.然而,至今仍没有一种疫苗可用于该病的预防. 本研究利用PCR技术和重叠延伸剪接技术(splice by overlapping extension,SOE),以牛分枝杆菌Vallee Ⅲ菌株的基因组为模板,扩增ag85b、esat-6、hsp65、mpb64基因和ag85b-esat-6、hsp65.esat-6、mpb64-esat-6融合基因,连接到真核表达载体pCDNA3.1(+)中,构建重组质粒pcDNA3.1-Ag85B(简称pCA)、pCDNA3.1-ESAT-6(简称pCE6)、pCDNA3.I-HSP65(简称pcH)、pCDNA3.1-MPB64 (简称pCM) pCDNA3.1-Ag85B.ESAT-6 (简称pCAE)、pCDNA3.1-HSP65.ESAT-6(简称pCHE)和pCDNA3.1-MPB64.ESAT-6(简称pCME).转染SP2/0细胞,检测目的基因的表达.以各重组质粒和pCDNA3.1(+)及PBS免疫BALB/c小鼠,免疫3次,每次间隔2周,1免后每周以牛分枝杆菌纯化蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)为包被抗原,间接ELISA方法检测血清抗体水平;以牛分枝杆菌PPD和刀豆蛋白A(ConcanavalinA,ConA)为刺激原,MTT法检测脾淋巴细胞增殖情况.3免2周后以ELISA试剂盒检测脾细胞分泌IFN-γ,的情况.结果表明,除pCH组外,其他各重组质粒免疫后小鼠血清抗体水平持续上升,与pCDNA3.1(+)对照组和PBS对照组相比差异显著(p<0.05).3免2周后,融合DNA疫苗免疫组的刺激值(SI值)与单价DNA疫苗免疫组相比差异显著(p<0.05).PPD刺激后融合基因DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN-γ高于单价DNA疫苗组(p<0.05),而ConA刺激后各疫苗组分泌的IFN--γ水平均高于PPD刺激时(p<0.05),其中以pCAE和pCME组最高.以上结果表明在诱导细胞免疫应答方面融合DNA疫苗要优于单价DNA疫苗. 同样,利用PCR和SOE技术,获得牛分枝杆菌mpb64-ag85b和mpb64-ag85b-esat-6融合基因,以pCDNA3.1(+)为载体构建了牛分枝杆菌多价组合和多基因融合DNA疫苗:二基因融合(pCDNA3.1-MPB64-Ag85B,简称pcMA)和三基因融合(pCDNA3.1-MPB64-Ag85B-ESAT-6,简称pCMAE)DNA疫苗;二价组合(pCA+pCM)和三价组合(pCA+pCM+pCE6)DNA疫苗,免疫BALB/c小鼠,以牛分枝杆菌BCG免疫组为阳性对照,以pCDNA3.1(+)及PBS免疫组为阴性对照,共免疫3次,每次间隔2周,BCG组仅初免时皮下免疫1次.1免后每周,以原核表达纯化的重组MPB64-Ag85B-ESAT-6蛋白(rMAE)和牛分枝杆菌PPD为包被抗原,以间接ELISA方法检测血清lgG水平及IgG亚类.每次免疫2周后以rMAE蛋白和PPD刺激,MTT法检测脾淋巴细胞增殖情况,试剂盒检测IFN-γ.,和IL.2的分泌情况.3免3周后以1×10<'6>CFU的BCG进行攻毒.攻毒3周后,以间接免疫荧光试验、肺脏荷菌数和病理组织学变化评价攻毒后的免疫保护效果.试验结果表明,融合DNA疫苗免疫后产生的血清抗体水平、淋巴细胞增值(SI值)水平、IFN-γ和IL-2水平明显高_丁多价DNA疫苗(p<0.05),以rMAE蛋白为包被抗原和刺激原时BCG免疫组的抗体水平、SI值和分泌的IFN-γ,IL-2的量明显低于融合DNA疫苗组,而与多价DNA疫苗组相当,以牛分枝杆菌PPD为包被抗原和刺激原时BCG免疫组的体液和细胞免疫指标均明显优于各DNA疫苗组.从攻毒保护效果来看,融合DNA疫苗组的保护效果明显优于多价DNA疫苗,达到了BCG疫苗的免疫保护水平,表明本研究制备的融合DNA疫苗具有良好的用前景,从而为牛结核病新型疫苗的研究奠定了基础.
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