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东方田鼠抗日本血吸虫相关基因E77.43的克隆和功能初步研究
中文名称: 东方田鼠抗日本血吸虫相关基因E77.43的克隆和功能初步研究
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论文编号: 3101871收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Cloning and Functional Study of Resistance-Associated Gene E77.43 Against Schistosma Japonicum Infection in Microtus Fortis
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 生物化学与分子生物学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 东方田鼠 日本血吸虫 抗性相关基因 组织表达谱 基因治疗 抗性基因 组织分布
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论文简介:东方田鼠为一种栖居于我国洞庭湖区的啮齿类动物,流行病学调查和人工感染实验研究已证明其对日本血吸虫感染具有天然抵抗作用,且这种抗性能稳定遗传。从东方田鼠体内分离其抗日本血吸虫的抗性物质,有助于人类阐明其抗性机理并寻找新的血吸虫病防治措施。在前期研究中,我们从东方田鼠骨髓cDNA文库中分离获得了一个具有显著杀伤日本血吸虫童虫的次级亚基因池E77。因此,我们拟从次级亚基因池E77中继续分离单个活性的基因,并探讨其生物学功能。 一、东方田鼠抗日本血吸虫相关基因 E77.43的克隆及组织分布我们从。E77中挑选出片段大小不同的单个基因进行杀伤日本血吸虫童虫体外实验,发现E77.43 cDNA转染HEK293细胞后,其转染后的表达产物于体外对日本血吸虫童虫具有显著杀伤作用。我们将该基因进行序列测定以及生物信息学分析。E77.43 cDNA全长1494bp,开放阅读框分析表明:E77.43含有333 bp的阅读框架,编码111个氨基酸。预测蛋白分子质量为12.2 kD,理论等电点为9.65;为一偏碱性的蛋白。将E77.43的核酸和编码蛋白质通过同源搜索和序列比较,未发现其与任何己知基因和蛋白质有显著的同源性,表明E77.43基因及其产物均是新的。此外,该编码产物还含有多个翻译后修饰位点,包括1个N-糖基化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点,2个肉豆蔻酸化位点。我们还应用RT-PCR分析了该基因的mRNA表达水平,组织表达谱分析结果显示:在mRNA水平上,E77.43在骨髓、脑、睾丸组织呈高表达,对其组织分布特点尚需通过蛋白质水平的验证。 二、E77.43原核表达、抗体制备及重组蛋白的体外杀伤 日本血吸虫童虫作用E77.43是东方田鼠特有的一个基因,它的生物学功能尚未明了。基因功能的发挥最终需要通过其编码产物即蛋白质来实现,因此,我们利用PCR方法扩增出E77.43的开放阅读框,将其定向克隆到pQE30原核表达载体,成功地于体外高效表达、纯化出pQE30-E77.43融合蛋白,其分子量大小与生物信息学预测结果一致。我们对原核蛋白能否对日本血吸虫童虫有杀伤活性进行了初步探讨。可喜的是我们发现复性的融合蛋白对日本血吸虫童虫具有明显的体外杀伤活性。 我们进一步将纯化的融合蛋白免疫家兔以制备多克隆抗体,ELISA检测获得了抗体效价为1:12800的多克隆抗体,Western blot检测结果证实该抗体结合E77.43融合蛋白的特异性。我们应用自制的抗E77.43多克隆抗体来检测:E77.43蛋白在东方田鼠不同组织的表达,Western blot检测结果显示E77.43蛋白在脑、睾丸组织呈高表达,该结果与mRNA水平检测结果基本相符,因此,我们认为该基因具有明显的组织分布特征,其在脑、睾丸组织的表达丰度显著高于其它组织,对其组织分布特点尚需进一步研究。东方田鼠E77.43的原核蛋白及其多克隆抗体的获得为我们研究该分子的生物学活性、作用机理、信号转导以及与其它分子相互作用及其与东方田鼠抗血吸虫的关系打下了良好的基础。 三、重组逆病毒的制备及其转导小鼠后的抗血吸虫感染作用 为了深入研究E77.43的生物学功能,我们构建了pRevTRE-E77.43,pRev-Tet-Off,pLXSN-E77.43重组逆转录病毒载体。将上述载体转染PA317细胞,分别用Hygromycin和G418筛选后获得了稳定表达的细胞株,并进行了重组逆转录病毒的包装、浓缩与纯化。我们通过静脉或腹腔途径将制备的重组病毒注射到日本血吸虫感染模型小鼠体内,以期探讨目的基因在小鼠体内的表达以及体内治疗血吸虫感染的作用。动物实验结果显示:病毒注射动物机体后3天目的基因就有表达,且一直能持续表达到41天以上;RevTRE-E77.43/Tet-Off和pLXSN-E77.43分别诱导小鼠产生了31.0%和16.9%的减虫率,说明E77.43能对血吸虫感染模型小鼠产生了一定程度的治疗效果。 四、AAV2-E77.43转导小鼠对日本血吸虫攻击感染的抵抗作用 为了进一步验证E77.43的生物学功能,我们还构建了pAAV2-E77.43重组腺相关病毒载体,并采用磷酸钙沉淀法转染HEK293细胞,包装并制备了纯度较高的rAAV-E77.43重组病毒,进而对体内肌肉注射血吸虫感染模型小鼠的有效性进行了探讨,结果显示经肌肉直接注射到小鼠体内后,第三天血浆中E77.43蛋白就开始表达,且一直能够稳定表达到41天;与空载体pAAV组比较,rAAV-E77.43的减虫率和减卵率分别为27.3%(P<0.01)、26.2%(P<0.01),另外,与空载体pAAV组比较,治疗组小鼠肝脏表面虫卵结节较少。由此可见,我们建立的rAAV2-E77.43病毒载体系统,经过肌肉注射途径能有效地将E77.43导入小鼠,并能介导小鼠部分抵抗血吸虫的攻击感染。综上所述,本实验从东方田鼠骨髓cDNA文库中分离出一个新的抗日本血吸虫感染相关基因E77.43,其广泛分布于东方田鼠多种组织、器官中。体外试验发现该基因的表达产物能部分杀伤日本血吸虫童虫,体内基因治疗实验也初步证实了其对血吸虫感染具有一定的预防保护效果。
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