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BRS-3肺内生物学效应、基因表达调控研究及天然配体分离
中文名称: BRS-3肺内生物学效应、基因表达调控研究及天然配体分离
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论文编号: 3101826收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: A Study on Pulmonary Biological Effects, Gene Expression Modulation and Natural Ligand Screening of BRS-3
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 生理学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 支气管上皮细胞 气道高反应性 BRS-3 PPARα AP-2α细菌双杂交 支气管 上皮细胞
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论文简介:目的:气道含有丰富的神经支配和神经内分泌细胞,可感知内外环境变化,释放大量神经肽,调控气道的各项功能,维持气道微环境稳态。蛙皮素样肽(BLPs)在哺乳动物肺内广泛存在,在肺脏生理病理过程中发挥重要作用。相应的,哺乳动物体内BLPs受体家族目前已发现3个成员,分别是胃泌素释放肽受体(GRPR)、神经介素B受体(NMBR)、蛙皮素受体亚型-3(BRS-3)。BRS-3是一个含有399个氨基酸的蛋白质,在正常体内的绝大多数组织表达量很低,而在发育中的肺组织及肿瘤组织中表达增高,且BRS-3的cDNA就是首次从小细胞肺癌细胞株中分离出来的,提示BRS-3可能与细胞的生长或损伤修复有关。由于BRS-3的生物学效应、基因表达调控及天然配体等目前仍不清楚,所以本课题围绕BRS-3的肺内生物学效应,基因表达调控和BRS-3天然配体进行了一系列研究。 方法与结果: 1.BRS-3在肺内的生物学效应研究 用臭氧连续应激家兔8天,每天1小时建立气道高反应动物模型,用原位杂交观察了BRS-3在动物模型中的时空分布。结果显示BRS-3于臭氧应激的第2天开始缓慢增高,于第4天达到峰值,之后逐渐下降。BRS-3主要分布在细支气管的纤毛柱状上皮细胞、终末细支气管的单层柱状上皮、Ⅱ型肺泡细胞和一些间质细胞。 为了研究BRS-3在AHR模型中表达上调的生物学意义,进一步观察了BRS-3激活对培养的人支气管上皮细胞损伤修复和增殖的影响。损伤修复测定采用机械损伤在融合的支气管上皮细胞单层上造成一小面积不规则缺损,用显微视频分析系统每隔4小时测量缺损面积一次,绘制时间与修复面积的直线回归方程,直线的斜率为损伤修复指数,斜率越大,损伤修复速度越快。应用这种方法,我们观察到BRS-3人工合成配体P3513可浓度依赖性促进BECs损伤修复,该效应可被PKA抑制剂H89所阻断,但似乎被钙调素抑制剂W7和酪氨酸激酶途径抑制剂PD98059所加强。MTT法也观察到P3513可浓度依赖性促BECs增殖,该效应可被H89、w7和PD98059所阻断。BRS-3的促损伤修复及促增殖效应可被:BRS-3 ASO所阻断。还对BRS-3的抗损伤保护作用进行了研究,以<'3>H—LIDR和LDH为损伤指标,Catalase为抗损伤指标,结果显示O<,3>应激使BECs<'3>H—UDR释放率增加,LDH活性增高,导致细胞损伤。P3513可显著降低O<,3>应激的BECs <'3>H—UDR释放率、LDH活性,增加Catalase活性。上述结果提示BRS-3在AHR肺组织的上调与活化可促进上皮的损伤修复,提高细胞抗氧化能力,发挥保护功能。 2.BRS-3基因表达调控研究 为了进一步认识AHR中BRS-3基因表达上调机制,对臭氧应激条件下BRS-3的转录因子调节谱进行了研究。实验首先用TESS软件对BRS-3启动子区转录因子结合位点进行搜索,然后根据搜索结果,设计了10条探针,覆盖所有的转录因子结合位点,应用EMSA和ChIP的方法筛选了调控BRS-3表达的转录因子。结果显示探针1、4、8、10有探针与蛋白结合形成的滞后带,能被100倍未标记探针所竞争,为特异性结合。通过突变探针结合实验和抗体超迁移实验,证实这4条探针结合的转录因子分别为PPARα、MTF-1、AP-2α和HSF—1。ChIP实验显示,PPAR α和AP-2α可特异性与BRS-3启动子结合。 紧接着,用基因定点突变技术观察了四种转录因子对BRS-3启动子活性的影响,结果显示PPARα与AP-2α的结合位点突变后,BRS-3启动子活性下降,PPARα与AP-2α结合位点同时突变,可完全抑制臭氧应激条件下BRS-3的激活,这一结果在BECs和HLF中都得到验证。随后用反义寡核苷酸技术观察了四种转录因子对BRS一3表达的影响,Western及EMSA证实了四种ASOs的有效性,他们可分别阻断四种转录因子的蛋白表达和结合活性。应用四种ASOs后,用原位杂交观察到臭氧应激可促进BRS-3的表达,PPARα和AP-2α ASO明显抑制BRS-3的表达,real-time PCR结果与上述结果一致。 还用免疫荧光观察了PPARα的核转位,结果显示臭氧应激使PPARα核转位增加,PPARα ASO可阻断臭氧应激条件下PPARα的核转位,这一结果在BECs和HLF中也都得到验证。 通过进一步的研究,用EMSA观察到。PPAR与AP-2α的活化在48小时的观察中具有双相性,real-time PCR检测显示BRS-3的表达与两种转录因子的激活一致,提示在臭氧应激条件下,PPARα与AP-2α特异性与BRS-3结合,共同调控BRS-3的表达。 3.BRS-3相互作用 蛋白筛选BRS-3表达质粒由美国Boston大学Weber教授惠赠,将该质粒酶切并克隆至PBT质粒,构建诱饵质粒。诱饵质粒经PCR、酶切和全长测序证实BRS-3插入正确,western blot证实该质粒可在IPTG诱导下表达,自激活鉴定显示其没有自激活作用。人胎脑文库购于美国 Stratagene公司。将诱饵质粒和文库质粒共转化并铺于含3-AT的选择性培养基进行初筛,随后将菌落移至含链霉素和3-AT的二重筛选平板进行二级筛选,然后提取单个文库质粒再分别与诱饵质粒共转化,并铺于选择性筛选培养基和非选择性筛选培养基上验证其相互作用,取双阳性克隆测序,及生物信息学分析,结果显示BRS-3可与13种蛋白相互作用,包括四种新蛋白。应用PULL—DOWN实验对9种已知蛋白与BRS-3相互作用进行了验证,结果显示有7种蛋白可与BRS-3发生相互作用,分别为胃泌素释放肽、睫状神经营养因子、蛋白酶抑制子-5、丝氨酸蛋白酶抑制剂、酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶C β 1、酪氨酸蛋白激酶2α1。应用生物信息学方法对四种新基因分析显示,除一种基因无完整ORF,且不能进行电子延伸外,其余3种均为在胎脑、胎肺、人胚干细胞及肿瘤细胞中高表达的蛋白,其中2种有跨膜区域,1种具有信号肽。 4.BRS-3天然配体分离实验 首先建立BRS-3高表达细胞株,并用[Ca<'2+>]瞬变测定对可能含有BRS-3天然配体的组织进行了初筛,结果显示人胚肺组织匀浆25kD以下组分可能含有BRS-3天然配体。然后收集转染和未转染的COS-7细胞,加入人胚肺组织匀浆,于4℃结合3小时后,裂解细胞,进行免疫共沉淀,然后在免疫沉淀物中加入40μl PBS液,35℃孵育30min使配体解离,离心取上清。或在免疫沉淀物中直接加入上样缓冲液,进行Tricine-SDS-PAGE鉴定,结果显示转染细胞洗脱物可引起[Ca<'2+>]瞬变效应,并且含有一种1kD大小的多肽,该多肽在未经洗脱的免疫沉淀物中浓度较高,切胶后对其进行N端氨基酸序列测序。测序结果显示该多肽为含有10个氨基酸残基的多肽,在各种蛋白质数据库中未找到显著同源性的蛋白,与蛙皮素的同源性为36%。通过放射配基亲和实验和结合竞争抑制实验,结果显示受体数量为80 fmol/10<'5>cells,K<,d>值为0.17 nmol/L,未标记的配体可竞争抑制<'125>I-配体与受体的结合,并呈剂量效应关系,在浓度为反应浓度的100倍左右时可发生完全竞争抑制。 结论:BRS-3的配体为一种具有10个氨基酸残基的多肽,BRS-3可与多种蛋白相互作用参与细胞信号转导及调控。在臭氧应激条件下,PPARα与AP-2α特异性与BRS-3启动子结合,促进BRS-3转录。BRS-3激活后,通过细胞内信号传递,促进BECs的损伤修复和增殖,提高细胞抗氧化能力,发挥保护功能。
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