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鼻咽癌抑瘤基因BRD7的转录调控研究
中文名称: 鼻咽癌抑瘤基因BRD7的转录调控研究
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论文编号: 3101782收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Transcriptional Regulation of a Nasopharyngeal Carcinoma Tumor Suppressor Gene BRD7
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 病理学与病理生理学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: BRD7基因 转录调控 启动子 顺式作用元件 反式作用因子 MicroRNA分子 DNA甲基化
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论文简介:溴区结构(Bromodomain)是近年来发现的广泛存在于多种生物中的一种高度保守结构域,可特异性地与组蛋白末端乙酰化的赖氨酸位点结合。Bromodomain蛋白通过与乙酰化组蛋白结合,改变染色质构象,协调多个转录复合物与染色质模板的有序结合而参与信号依赖性基因转录调控。BRD7基因是利用cDNA代表性差异分析法筛选出的 Bromodomain基因。它在鼻咽癌细胞和组织中表达下调。前期研究工作表明:BRD7是一个细胞周期特异性转录相关因子,一方面通过调节Ras/MEK/ERK和Rb/E2F信号通路中的关键分子而参与细胞周期调控,另一方面通过与乙酰化组蛋白H3结合,参与核内组蛋白乙酰化信号传递。过表达BRD7基因可抑制鼻咽癌细胞增殖和细胞周期进程,并部分地逆转鼻咽癌细胞的恶性表型。为了揭示BRD7基因在鼻咽癌细胞和组织中表达下调的分子机制,更深入地阐明BRD7基因的生物学功能,本课题展开了BRD7基因的转录调控研究。 【BRD7基因启动子的克隆、鉴定及精细定位】 生物信息学分析为基因转录调控研究提供了一个很好的切入点。在线程序PromoterInspectot-分析结果表明BRD7调控区-375/+416的区间为其候选启动子区,而在线程序PromoterScan的预测结果表明-391/-141的区间为BRD7的候选启动子区。以正常人外周血细胞基因组DNA为摸板,利用PCR技术,获得了BRD7调控区长片段-711/+496,并证实该区域具有与病毒SV40启动子同等强度的启动活性。进一步以该长片段调控区为模板,利用缺失突变体报告质粒构建技术和荧光素酶活性分析系统,定位了BRD7基因的近距离启动子区-404/+46,并发现BRD7启动子区-293/-168的125bp区域是其发挥启动子活性的必需序列。 为了进一步获得BRD7基因的最小启动子序列,分别在其近距离启动子片段-404/+46的5'、3'或内部缺失部分序列,构建一系列缺失突变体报告载体,并将它们分别转染不同细胞系中,发现BRD7基因-266/-212的55bp区间为其最小启动子区域,而且这一最小启动子选择性地在c-Myc缺失的细胞株中发挥启动活性。 【BRD7启动子区顺式作用元件和反式作用因子的鉴定和功能研究】 真核基因的转录调控是一个非常复杂的生化反应过程,数目惊人的蛋白因子参与了基因的转录调控。在线软件MatInspector分析结果表明BRD7启动子区是一个不含TATA盒,也不含CAAT盒的GC富集区。它含有多个GC盒,多种转录因子结合位点,如:KLF,Spl,E2F,MYC-MAX和AP2等结合位点。凝胶迁移率分析(EMSA)证实了BRD7基因启动子区的Spl/MYC-MAX(-223/-198)、E2F-6(-243/-229)以及E2F(-183/-169)结合位点。超变动(Supershift Assay)和免疫染色质共沉淀(ChIP)实验证实了转录因子c-Myc、E2F6和Spl对这些位点的特异性结合。 利用转基因技术,发现过表达c-Myc能大幅度地下调BRD7启动子活性并明显抑制BRD7基因的内源性mRNA表达水平;封闭内源性c-Myc的表达使BRD7启动子活性在鼻咽癌5-8F细胞中提高了10倍以上,同时也明显上调了BRD7基因内源性mRNA的表达水平。采用 MicroRNA芯片分析发现,封闭内源性c-Myc的表达在鼻咽癌细胞中上调了14个miRNA分子的表达,其中hsa-miR-224上调了66.49倍,是上调幅度最大的miRNA基因,同时还下调7个miRNA分子的表达,hsa-miR-200c和hsa-miR-141的表达下调了10倍以上。在线程序预测这些差异表达miRNA分子的靶基因,发现它们大多涉及细胞周期和凋亡等信号分子通路。 过表达转录因子Spl以浓度依赖性方式在鼻咽癌细胞中上调BRD7启动子活性,但并不足以使BRD7启动子活性上调至全长启动子-404/+46的活性;转录因子Spl结合位点的特异性竞争剂光辉酶素A(Mithramycin A)可大幅度地抑制BRD7启动子活性,并明显下调BRD7基因内源性mPNA表达水平。但转录因子E2F6对BRD7基因最小启动子片段没有活性调节作用。 为了进一步确定BRD7启动子区-223/-198的MYC-MAX/Spl重叠结合位点和-243/-229的E2F6结合位点的重要性,分别构建了这两个结合位点的点突变和缺失突变报告基因载体。荧光素酶分析系统结果表明:突变MYC-MAX/Spl(-223/-198)重叠结合位点中的三个关键碱基(C/A,G/T,G/A)使BRD7最小启动子活性在鼻咽癌5-8F细胞中增加了4个数量级;但缺失MYC-MAX/Spl结合位点并不影响BRD7最小启动子的活性。而突变E2F6结合位点的4个关键碱基不影响BRD7最小启动子活性,但缺失E2F6结合位点的15个关键碱基却大幅度地增加了BRD7最小启动子活性。 另外,免疫共沉淀和免疫共定位实验都确证了鼻咽癌5-8F细胞中蛋白因子c-My与Spl的直接交互作用,提示蛋白因子c-Myc结合于Spl从而竞争或覆盖了Spl与其相应位点结合的基序可能是c-Myc抑制BRD7启动子活性和内源性表达的另一调节因素。 【DNA甲基化抑制BRD7基因的表达,去甲基化恢复其表达】 c-Myc和Spl对BRD7启动子活性调节至关重要,但在鼻咽癌细胞中抑制c-Myc的表达或过表达Spl蛋白因子都不足以使BRD7最小启动子活性上调至全长启动子-404/+46的性或完全恢复BRD7基因的mRNA表达水平,提示在BRD7基因转录调控机制中还存在未知的调节因素如:CpG岛或Spl结合位点甲基化等。利用欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS)和美国softberry软件公司推出的CpGFinder程序在线扫描BRD7基因转录起始位点上游2000bp的gDNA序列,分别发现其5'上游-418/-56或-374/-4的区间为一CpG岛。这两个软件的预测结果大部分重叠,且与BRD7近离启动子-404/+46重叠。利用BRD7基因启动子区特异性甲基化和非甲基化引物进行甲基化特异性聚合酶链反应(MSP-PCR),发现BRD7启动子在所有鼻咽癌细胞系中都呈部分甲基化状态,且其甲基化程度与BRD7基因mRNA的表达水平呈负相关。MSP-PCR测序结果表明BRD7基因启动子区共有10个甲基化CpG位点,它们分别涉及位于-353/-337的Spl结合位点、-330/-317的Spl结合位点、-260/-246的MYC-MAX结合位点、-223/-198的Spl结合位点以及-243/-229的E2F结合位点,另有两个位于翻译起始位点ATG的附近。利用SssI甲基转移酶能将腺苷甲硫氨酸(H.SAM)中的甲基转移至基因组DNA CpG位点的非甲基化胞嘧啶"C"上,使原本未甲基化的"C"发生甲基化的特点,分别将野生型双链寡核苷酸探针Wt E2F-6(-243/-229)和WtSpl/MYC-MAX(-223/-198)经SssI甲基转移酶处理后,进行EMSA分析,发现这些甲基化的寡核苷酸探针不能与核蛋白结合。同样,将BRD7启动子报告载体pGL3-404/+46、pGL3-404/+46/GFP经SssI甲基转移酶处理后,发现它们在COS7和BHK-21细胞以外的所有癌细胞株中丧失了全部的启动子活性。 3.75μM的甲基化酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷(ADC)就足以在鼻咽癌5-8F细胞中完全逆转BRD7启动子甲基化状态,并最大幅度地上调BRD7基因mRNA和蛋白质表达水平,其上调幅度分别为76.7%和63.3%。流式细胞仪分析结果表明,3.75μM的5-脱氧杂氮胞苷具有阻滞鼻咽癌细胞周期G2/M、S期进程和诱导鼻咽癌细胞凋亡的作用。MicroRNA芯片分析结果发现,3.75μM的5-脱氧杂氮胞苷在鼻咽癌5-8F细胞中上调了10个miRNA分子的表达,其中hsa-miR-122a上调了63.2倍,是上调幅度最大的miRNA分子,同时还下调7个miRNA分子的表达,其中hsa-miR-203下调了7.79倍。利用在线程序预测其靶基因,发现这些靶基因主要涉及细胞周期和凋亡等信号分子通路。 更为重要的是:通过检测36例鼻咽癌病人组织和16例正常人外周血细胞中BRD7基因的甲基化状态,发现BRD7基因启动子区的甲基化频率在鼻咽癌病人的鼻咽组织中为100%,而在正常人群外周血细胞中为50%,且在正常人群中呈微弱甲基化状态。总之,通过本课题研究,获得了BRD7启动子及其精细位置,较系统地阐述了BRD7启动子的特征及其顺式作用元件和反式作用因子的组成和功能,较详细地探索了DNA甲基化对BRD7启动子活性、mRNA和蛋白质表达水平的影响及分子机制,并获得了BRD7基因启动子甲基化可能成为界定鼻咽癌病人和正常人群的生物分子标志物之一的重要信息。这些研究结果将有助于全面地了解BRD7基因的生物学功能,明确BRD7基因在鼻咽癌癌变中的作用机制,并为其潜在的临床应用提供科学的理论和实验依据。
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