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新型非病毒载体介导融合自杀基因靶向治疗结肠癌的实验研究
中文名称: 新型非病毒载体介导融合自杀基因靶向治疗结肠癌的实验研究
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论文编号: 3101730收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Novel Non-viral Vector-Mediated Fusion Suicide Gene Yeast CDglyTK Targeted Therapy of Colon Carcinoma Experimental Study
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 内科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 结肠癌colorectal cancer(CRC) yCDglyTK融合自杀基因 非病毒载体 磷酸钙纳米粒 结肠癌 基因靶向治疗 病毒载体
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论文简介:结肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤,2000年世界癌症流行趋势分析表明,全球结、直肠癌发病率居恶性肿瘤第三位,死亡率居第四位<'[1]>。近些年来我国大肠癌发病率的上升趋势亦十分明显。其中城市结肠癌的发病率以4%的年增长率递增,而男性结肠癌患者增加了58.8%<'[2,3]>。由于其临床表现常较隐匿且缺乏特异性,难以早期发现,大多数患者就诊时已属于中晚期,且结肠癌手术切除后转移或复发率高。化学治疗具有严重的毒副作用,如骨髓抑制,心、肝、肾等器官的损伤。手术切除是其重要的治疗手段,但中晚期患者术后转移或复发率高,化疗毒性反应大。因此需要寻求新的治疗方法。基因治疗是当前研究的热点,但面临载体安全性、靶向性差两大问题,临床使用受到限制。 载体的问题是基因治疗的关键。许多的载体,病毒载体和非病毒载体以前已广泛应用,病毒载体主要包括腺病毒,逆转录病毒,腺相关病毒<'[1-3]>等;但病毒载体在安全性方面存在潜在的危险;免疫原性比较强,注射到机体后很快会被机体的免疫系统排斥,当静脉注射高浓度的腺病毒载体会使肝脏发生严重的炎症反应<'[4,5]>;非病毒载体目前常用的有脂质体及多聚阳离子聚合物;但脂质体和阳离子聚合物介导基因转移缺乏组织的特异性和靶向性,转染效率较低且易被网状内皮系统吞噬,基因表达时间短;因此研制新型的非病毒载体己成为研究的热点,纳米颗粒具有小尺寸效应,表面效应,随着颗粒直径变小,比表面积将会显著增大,故具有很高的化学活性,因而纳米成为了最有应用前景的非病毒载体。研究表明,纳米颗粒在体内的循环时间明显长于普通大小的颗粒<'[6]>,在短时间内,不会很快被吞噬细胞清除,从而更多的渗出到血管外,组织间隙,延长与细胞的接触时间,提高转染效率;通常质粒DNA进入血管后很快被核酸酶消化降解<'[7]>,但纳米基因载体有浓缩,保护DNA功能,与DNA形成一致密的结构,使DNA不被核酸酶消化降解<'[8,9,10]>。为了提高基因治疗载体的靶向性,降低对正常细胞的损伤,人们设计了很多方法,靶向性转录技术便是其中之一<'[11]>。靶向性转录技术是利用组织和细胞特异性启动子控制基因的转录,从而使治疗基因在特定的细胞中表达,达到靶向治疗的目的<'[12]>。癌胚抗原(CEA)是结肠癌等恶性肿瘤相对特异性标志物,在结肠癌中的阳性率约为70%-90%<'[13]>,在结肠癌肝转移及复发病例其阳性率更高,可作为结肠癌重要的监测指标,且癌胚抗原的肿瘤特异性也被许多肿瘤基因治疗所采用。CEA转录调控元件包括增强子元件和在5侧翼区域的启动子,这些元素能调控目的基因在癌胚抗原(CEA)为阳性的癌组织中表达,从而达到靶向治疗的目的。 目的:本课题探讨由CEA启动子、CMV增强子组成的高活性嵌合启动子,通过融合启动子的调控提高融合自杀基因yCDglyTK在靶细胞表达的特异性;并以无毒副作用生物相容性好的磷酸钙纳米为载体,将该自杀基因靶向导入结肠癌细胞中,以达到提高基因治疗靶向性及安全性的目的。 方法:本研究利用化学方法制备一种30nm大小、分散均匀的磷酸钙纳米颗粒,采用PCR、RT-PCR、融合PCR、酶切、连接等技术构建由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK表达载体,并以该纳米为载体将pcDNA3.1(-)CV·yCDglyTK质粒表达载体转染结肠癌lovo细胞系进行体外实验研究,荧光显微镜、流式细胞仪检测纳米的转染效率,分别用RT-PCR、Western-blot杂交等方法检测鉴定yCDglyTK融合自杀基因在lovo细胞内的表达;MTT法检测5-FC、GCV对野生型lovo细胞的毒性;MTT法、克隆形成实验检测自杀基因前药系统对表达自杀基因的lovo细胞的杀伤效应;绘制细胞生长曲线反映该系统对lovo细胞生长的影响;免疫组化及免疫荧光检测治疗前后自杀基因蛋白表达水平的变化;用高效液相色谱(HPLC)法测定处理前后前体药物5-FC向5-FU转化效率的变化;用peDNA3.1(-)CV·yCDglyTK阳性克隆细胞移植Balb/C裸鼠进行肿瘤治疗的体内试验。结果:在经不同浓度的氯化钙等试剂修饰后,磷酸钙纳米颗粒能与质粒DNA有效结合,通过复合体吸附在细胞膜上并进入细胞内,增加进入细胞内DNA量,提高基因转染的效率,并且质粒DNA与纳米颗粒形成的复合体能有效的抵抗血清中酶类对DNA分子的降解,有效的保护DNA分子的完整性;用绿色荧光蛋白(GFP)基因作报告基因,与磷酸钙纳米颗粒结合后转染常规培养的lovo细胞,用荧光显微镜及流式细胞仪检测,发现该纳米具有较高的转染效率; 5-FC和GCV在高浓度(5-FC>200u咖l,GCV>50 ug/ml)时,对野生型Lovo细胞亦有一定的杀伤作用;对于yCDglyTK阳性lovo细胞,当5-FC的浓度为10ug/ml和200ug/ml时,细胞存活率分别是63.23%和11.02%;同时,结果显示,yCDglyTK阳性lovo细胞在两种前体药物5-FC和GCV同时存在的条件下,并没有大多数文献报告的显示出协同杀瘤作用,其作用反而低于单独使用5-FC;200ug/ml5-FC处理yCDglyTK阳性lovo细胞24小时后,用高效液相色谱法测定细胞上清中5-FU浓度是168ug/ml,5-FC向5-FU转化效率是84%;旁杀效应实验显示,在200 ug/ml 5-FC存在时,只要pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK质粒有20%的转染效率,细胞的相对存活率将下降为32.6%,说明该融合自杀基因前药系统具有有强大的“旁杀效应”;动物试验中,CVyCDglyTK+5-FC组的肿瘤与CPNP-CVyCD-glyTK+5-FC组、CPNP-CMVyCDglyTK+5-FC组有显著性差异(P<0.05),与yCDglyTK+PBS及Lovo+5-FC组有极显著性差异(P<0.01)。这说明纳米介导的自杀基因前药治疗均有明显的抑瘤作用。 结论: 1)磷酸钙纳米粒能有效介导pcDNA3.1(-)CV·yCDglyTK自杀基因质粒载体转染lovo细胞,且未显示明显毒副作用,因此该纳米可能成为一种新型的用于基因治疗的非病毒载体。 2)5-FC与GCV对yCDglyTK阳性细胞均有明显杀伤作用,但二者无协同作用,其作用弱于单独5-FC而强于GCV。 3)该融合自杀基因前药系统具有有强大的“旁杀效应”。 4)该融合自杀基因前药系统,当前体药物浓度5-FC(200 ug/ml,GCV(50ug/ml,在此浓度下,对不含自杀基因的lovo细胞毒性很低。 5)体外与体内实验结果均显示,以磷酸钙纳米为载体介导CEA调控下的自杀基因在肿瘤的治疗中显示良好的靶向杀伤效应。
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