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异常核型人类胚胎干细胞向肿瘤演进的初步研究
中文名称: 异常核型人类胚胎干细胞向肿瘤演进的初步研究
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论文编号: 3101671收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: The Primary Researches about the Tumor Progression from the Aberrant Chromosomal Karyotypic Human Embryonic Stem Cells to Cancer
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 遗传学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 人类胚胎干细胞 核型 基因差异表达 肿瘤演进 胚胎干细胞 细胞遗传 基因表达谱
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论文简介:第一章异常核型人类胚胎干细胞的鉴定及细胞遗传学的分析。 目的:检测异常核型人类胚胎干细胞的生物学及细胞遗传学特性并探索随着传代的进行,染色体发生改变的规律。 方法:对人类胚胎干细胞,在体外培养的过程中,每5-10代进行染色体的分析,通过 G 显代、比较基因组杂交及原位杂交技术检测并确定细胞核型。对实验采用异常核型人类胚胎干细胞株chHES<,3>进行三个方面的检测,胚胎干细胞的未分化特性,如胚胎干细胞表面标记,碱性磷酸酶(AKP)活性:体内外分化能力检测,如拟胚体形成能力,胚层相关基因表达,体内畸胎瘤形成等。 结果:异常核型的人类胚胎干细胞染色体检测发现:在早期的变异中(P34),表现为单一的核型,核型为46,XX,dup⒈(p32pter);传代到P44-P99时,核型日益复杂无序,出现累及多条染色体的结构重排和复杂的重排,代基础上X三体重新变成X二体。异常人类胚胎干细胞(chHESC3)生物学特性均符合国际胚胎干细胞建系标准,细胞表达SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、Oct4 等胚胎干细胞的特异性标记,AKP染色呈阳性;扫描电子显微镜观察,相对正常核型的HES细胞,异常核型的HES细胞质内拥有更发达的细胞器结构;chHESC3 脱离饲养层细胞后在含有血清替代物的培养基中悬浮培养能够形成拟胚体,对拟胚体进行检测发现:拟胚体表达内、中、外胚层的标志基因如 AFP、tansferrin、KDR、nestin、SOXl 等,而全能性相关基因nanog、oct4表达明显下调;异常核型的人类胚胎干细胞注射到SCID鼠大腿体内形成畸胎瘤,包含有来源于三个胚层的细胞。 结论:正常与异常核型chHESCs-3细胞株仍保持未分化状,具有多能性;异常核型的人类胚胎干细胞具有正常人类胚胎干细胞的特征,也是一种胚胎性细胞;核型的改变符合肿瘤染色体变化的规律。 第二章异常核型的人类胚胎干细胞表型特征。 目的:研究异常核型的人类胚胎干细胞细胞细胞生物学表型特征。 方法:采用在亚优化培养条件下,观察正常核型、异常核型的人类胚胎干细胞体外培养状况;检测正常核型、异常核型人类胚胎干细胞细胞周期的分布;检测正常、异常核型人类胚胎干细胞细胞凋亡率;检测体外形成单克隆能力;检测正常核型、异常核型胚胎干细胞细胞群落中不同亚群分布;生物信息学分析单纯一号染色体重复区域与细胞增殖、细胞周期调控、肿瘤演进相关基因并进行检测。 结果:在亚优化培养条件下,正常核型的人类胚胎干细胞分化严重,具有很高的分化比例,但是异常核型的人类胚胎干细胞细胞在克隆的边缘或中央较容易保持未分化状态;正常核型的人类胚胎干细胞细胞周期中 S 期细胞的比例为 34.12±0.8054%;在复杂核型异常组早期(P70-110)S期细胞所占的百分比为35.08±3.96%,G1期细胞则是52.16±8.38%。在复杂核型组晚期(P120-180),S期细胞所占的百分比是47.6±7.54%,而G1期细胞比例下降至37.2±3.09%,随着传代次数的增加,S期细胞在细胞周期中所占的比例变得越来越高。 结论:异常核型的人类胚胎干细胞具有更强的保持未分化能力、具有更强的自我更新的能力、更强的抗凋亡能力;正常核型的HES细胞与异常核型的HES细胞群落中存在着明显的异质性,处在原始干细胞不同发育的阶段。 第三章异常核型的人类胚胎干细胞向肿瘤演进的表型。 目的:比较正常核型、复杂核型人类胚胎干细胞和EC细胞致瘤的差别,评估异常核型的人类胚胎干细胞体内致瘤能力。 方法:通过畸胎瘤实验模拟异常核型的人类胚胎干细胞向肿瘤演进的过程。将异常核型的人类胚胎干细胞分为三组:1)核型正常组;2)核型变异组(复杂核型);3)畸胎癌干细胞组;取生长状态较好的人类胚胎干细胞注射入严重免疫缺陷小鼠后退肌肉内,观察肿瘤大小,监测小鼠的体重随时间的关系,10周后处死SCID鼠,制备组织切片,HE染色后光镜下观察细胞的组织形态,原始神经管样结构,并与临床的畸胎瘤标本进行比较;不同发育时间正常核型人类胚胎干细胞致畸胎瘤标本的比较;免疫组织化学法检测畸胎瘤中各分子的表达情况。 结果:异常核型的人类胚胎干细胞形成的瘤组织内可见数量不等的三个胚层衍化的组织:分化程度为未成熟、欠成熟和完全成熟的瘤组织,各胚层瘤组织成份互相掺杂,可见分化成熟的骨、软骨组织、鳞状上皮、腺上皮、肝脏组织等,而分化不成熟的间叶组织及神经组织较多。 结论:异常核型的人类胚胎干细胞所致的畸胎瘤为不成熟畸胎瘤Ⅲ级,瘤体内存在很多未分化完全的组织和细胞,具有干细胞的特征,具有高增殖的潜能,具有向肿瘤、肿瘤干细胞演进的趋势。 第四章异常核型的人类胚胎干细胞向肿瘤演进分子机制的初步探讨。 目的:分析异常核型的人类胚胎干细胞向肿瘤演进的分子机制 方法:收集正常核型,1 号染色体重复的、复杂核型的人类胚胎干细胞及畸胎癌细胞四种样本,通过基因芯片进行基因表达谱的分析,对表达差异基因进行了染色体的定位分析和各染色体上表达率的分析,对具有表达差异的基因进行了生物学功能的分析、聚类分析及细胞信号传导的分析。 结果:比较了正常核型的chHES-20(P11),1 号染色体异常的chHES-3 (P72),复杂核型的 chHES-3 (P182)和人胚胎癌细胞(NTERA-2)的基因表达谱。在芯片的20387个基因中,以上四个样本分别有12378、11001、11375和11096个基因表达,相对于其他三组来说,正常核型的人类胚胎干细胞表达较多的基因,而其他三组细胞基因表达数目相差不大。通过分析,正常核型的HES中有1176个基因特异的表达,1号染色体异常的HES中有280个基因特异表达,而复杂核型的HES中有359个基因特异表达。由于1号染色体短臂的重复是所有异常核型chHES-3细胞的共同特点,为了了解染色体的变化是否与基因的表达存在一定的关系,我们把在三个HES中表达的差异基因利用 Visual inspection and initial statistical软件进行了染色体的定位分析。1 号染色体异常的HES相对于正常核型而言,共有629个上调的基因,其中84个主要集中在1号染色体短臂,特别是在1p32-36区域内,占13.35%。而发现的2504个下调基因则平均分散在所有的染色体上。复杂核型的HES细胞相对于正常核型的髓S细胞来说,有1285个基因上调,其中有206个基因主要集中在1号染色体上,有117个基因在1P32-36区域内,占9.1%;在全能性基因这一组,在所有样本中都表达的,18个严格意义上的全能性相关基因及候选基因中,POU5F1、SOX2、Nanog、LDB2、GABRB3、FGFR4、LEFTY2、DNMT3B、CD9 这九个基因渐进性的升高。在21个外胚层发育相关的基因中,FN1、MS12、NEDD1、SEPT2、NEFH、NEDD4、PAX6、OTX2、MCFD2、SOX3这九个基因;在28个与中胚层发育相关的基因中,EOMES、FLT1、GATA2、HLA-C、KDR、LMO2、MYLA、PECAM1、PITX2、RUNX1、T、THBS1、THBS2、VCAM1这 14 个基因;在七个和内胚层发育相关的基因中,AFP、CER1、FOXA2、GATA4、GATA6 and HNF4A 这六个基因,它们都有下降的趋势;在正常核性、异常核性与畸胎癌细胞中,我们全面的比较了重要信号传导通路中分子的基因表达谱。在与Wnt信号传导相关的差异基因中,在1号染色体异常的HES细胞和复杂核型的HES细胞中,效应分子 GSK-3beta 有一个明显的下降;比较了四个样本中的 Hst(FGFR1)、MDM2、BCL2、LMO2、ERBB2、TPM3、NTRK1、MET、CDK4、LMO1 等10个原癌基因表达。其中 ERBB2、TPM3、TPM4、FGFR1、MET和CDK4等6个基因在四个样本中都表达,如FGFR1基因卷入了FGF信号传导通路,CDK4在细胞周期方面发挥重要的作用。 结论:异常核型的人类胚胎干细胞自我更新能力增强的同时,向各胚层分化的能力减弱;异常核型的人类胚胎干细胞中原癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因表达发生改变,这些基因的改变是引起细胞生物学表型的原因。
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