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重组人白细胞介素10基因慢病毒载体的构建及其镇痛效应的研究
中文名称: 重组人白细胞介素10基因慢病毒载体的构建及其镇痛效应的研究
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论文编号: 3101635收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: The Construction and the Analgetic Effect of Recombinant Lentiviral-vector with Human Interleukin-10 Gene
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 外科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 慢病毒载体 人白细胞介素10 星形胶质细胞 促炎症因子 高迁移率族蛋白-1 疼痛 基因治疗
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论文简介:神经病理性疼痛是一种难治性的慢性疼痛综合症,尽管药物治疗神经病理性疼痛有数十年的历史,但疗效一直欠佳。最近一些研究认为脊髓神经胶质及其释放的致炎性细胞因子与神经病理性疼痛密切相关,神经胶质细胞的活性及其下游的信号分子可能成为治疗神经病理性疼痛的重要靶点。白细胞介素10(Interleukin-10,IL-10)是重要的抗炎细胞因子,能抑制多种细胞合成与释放促炎细胞因子,有研究证明IL-10对脊髓损伤、慢性坐骨神经压迫性损伤、鞘内注射gp120(HIV1的包膜蛋白)等原因导致的大鼠神经病理性疼痛有显著治疗效果。研究证明将镇痛相关基因导入中枢神经系统能取得较好的镇痛作用,复制缺陷的病毒载体理论上具有高效、安全和稳定的特点,具有良好的应用前景。以HIV1来源的慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒,其最大特点是转染效率高、易整合、不仅感染分裂期细胞,还可感染非分裂期细胞,并可以在体内较长期的表达,且安全性较好。因此,本研究拟构建含人白细胞介素10基因(human Interleukin-10,hIL-10)的重组慢病毒载体(Lentivector,LV),观察其离体和在体感染后IL-10的过表达及对慢性神经病理性疼痛的镇痛效应。 目的 构建含人白细胞介素10基因的重组慢病毒载体LV/hIL-10,观察LV/hIL-10对激活的星形胶质细胞的干预作用及其对慢性疼痛模型大鼠(chronic constriction injury,CCI)的镇痛效应,初步探讨HMGB1是否参与了CCI大鼠的痛敏维持。 方法 1.合成引物,以pCYIL-10质粒为模板,PCR扩增出hIL-10基因,并重组到质粒pWPXL-GFP,酶切、测序鉴定正确后,将重组质粒pWPXL-hIL-10与包膜质粒pMD2.G、包装质粒psPAX2共转染到293T细胞,包装出复制缺陷的慢病毒颗粒,进行病毒滴度的测定。 2.将DI TNC1(大鼠大脑皮质组织来源的星形胶质细胞株)细胞培养分瓶后,用不同浓度(0、250、500、750、1000ng/mL)大肠杆菌的LPS作用于DI TNC1 8h后,ELISA测定促炎因子TNF-α、IL-1β的分泌。500ng/ml LPS作用于DI TNCl不同时间后,PT-PCR测定TNF-α、IL-1β和晚期炎症介质高迁移率族蛋白-1(High MobilityGroup Boxl,HMGB1)的mRNA表达,ELISA测定TNF-α、IL-1β的分泌,Western Blot测定HMGB1的蛋白表达。LV/hIL-10、LV-GFP瞬时转染DI TNC1,4h后检测IL-10的mRNA表达和蛋白分泌,LV/hIL-10、LV-GFP转染LPS所致DI TNC1细胞后,分别测定各时点TNF-α、IL-1β和HMGB1 mRNA的表达及其分泌。 3.纯种健康清洁级成年雄性SD大鼠135只,随机分为9组:CCI疼痛模型4组(C0、C1、C2、C3),假手术4组(S0、S1、S2、S3)和正常对照组(N组)。分别给予蛛网膜下腔注射LV/hIL-10(C1组、S1组)、LV-GFP(C2组、S2组)、生理盐水(C3组、S3组),C0组、S0组为对照组(不做鞘内置管,不给药)。观察各组术后3d、7d、14d、21d、28d的疼痛行为学的改变及3d、7d、14d脊髓、脑皮质、海马中的IL-10、IL-1β、TNF-α、ftMGB1的mRNA和蛋白表达。C0组、S0组及NN笫7d测试痛阈后各取3只深麻醉下灌注取材,免疫组织化学法检测大鼠脑皮质、海马、脊髓组织GFAP、NF-kB的表达。 结果 1.从pCYIL-10质粒中扩增得到含PmeI多功能酶切位点的hIL-10基因片段,hIL-10基因重组到pWPXL-GFP载体,酶切鉴定的电泳结果显示,pWPXL-hIL-10质粒含有530bp左右的插入基因片断,测序结果显示pWPXL-hIL-10质粒上插入片段的序列与人IL-10基因序列完全一致。并获得了高滴度(2x10<'10>)的重组慢病毒LV/hIL-10。 2.不同浓度的12S诱导DI FNC1细胞8h后,TNF-α、IL-1β的分泌以LPS浓度为500ng/ml最为明显,500ng/ml LPS诱导DI TNC1后TNF-α、IL-1β mRNA的表达2h上调最显著。HMGB1的mRNA表达12h最显著,蛋白表达在18h达高峰,24h仍维持较高的水平。培养基上清中HMGBl蛋白的分泌18h最多。LV/hIL-10感染DI TNC1细胞4h后,IL-10表达明显上调,LV/hIL-10感染LPS所致DI TNC1细胞后,明显抑制TNF-α、IL-1β和HMGB1 mRNA的表达及其蛋白分泌。 3.CCI模型大鼠术后3d出现痛觉异常现象,7d最明显,术后第7d观察到大鼠的对侧后爪有明显的触痛异常(镜像疼痛)。CCI大鼠脑皮质、海马、脊髓组织中GFAP、NF-kB的表达在7d时呈强阳性,腰段脊髓TNF-α、IL-1β、IL-10在术后3d、7d表达最明显,14d时基本不表达。HMGB1 7d时表达增强,14d时维持较高的水平。在脊髓、脑皮质、海马三种组织中,本实验所测各指标以脊髓中的表达最显著。CCI组鞘内注射LV/hIL-10 3d后痛觉异常明显缓解,同时检测脊髓中的IL-10表达上调明显,而TNF-α、IL-1β的表达明显下调,术后14d脊髓的HMGB1表达明显下调。 结论 1.成功构建了含人白细胞介素10基因的慢病毒载体:LV/hIL-10 2.LPS激活星形胶质细胞产生免疫细胞样作用,分泌TNF-α、IL-1β和HMGB1(HMGB1分泌出现较晚且维持的时间较长),LV/hIL-10能抑制其分泌作用。 3.证实了慢性病理性疼痛的产生和维持与星形胶质细胞激活后释放炎症细胞因子密切相关。鞘内注射LV/hIL-10后明显抑制脊髓中TNF-α、IL-1β、HMGB1的表达,有效逆转CCI大鼠的痛觉异常,起到明显的镇痛作用。 4.HMGB1对慢性病理性疼痛的发展和维持可能起重要作用,有望成为慢性疼痛治疗的一个新靶点。
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