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应用ShRNA研究HBX基因表达和三氧化二砷对HepG2细胞凋亡特性的影响
中文名称: 应用ShRNA研究HBX基因表达和三氧化二砷对HepG2细胞凋亡特性的影响
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论文编号: 3101618收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Study on Effects of HBV X Gene Expression and Arsenic Trioxide on Cell Apoptosis in HepG2 Cells by shRNA
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 内科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: HBX基因 三氧化二砷 肝癌细胞 HepG2 RNA干扰 细胞凋亡 p53
简介目录: 点击此处 免费索取本论文简介和目录>>
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论文简介:目的:应用shRNA介导的RNA干扰(RNAi)研究HBV X基因(HBX)表达水平和三氧化二砷(As2O3)对HepG2细胞凋亡及p53表达和活性的影响。 方法:从质粒pEcob6中PCR扩增HBV X全基因,利用pCEP4和pcDNA3.1(+)二者多克隆位点的特点,选用pGEM -T Easy Vector构建中间载体 pEasy-X,分别酶切后连接特异性片段构建载体 pCEP4-X和pcDNA3.1(+)-X。应用脂质体介导转染pCEP4-X和pcDNA3.1(+)-X入HepG2细胞,Hygromycin和Neomycin筛选阳性细胞克隆,传代培养后PCR、RT-PCR 和 Western Blot鉴定HBX的表达。选用cGFP标记的pRNAT-U6.1/Neo构建序列特异性的shRNA表达载体pXi-1、pXi-2和序列无关对照pXi-3,转染入HepG2-pCEP4-X细胞,Hygromycin和Neomycin筛选GFP阳性的细胞克隆,传代培养。RT-PCR和Western Blot分析HBX的表达水平。以2pxnol/LAs2O3处理HepG2细胞和HepG2-pCEP4-X细胞36小时,以未处理细胞为对照,流式细胞术分析细胞凋亡比和细胞周期,Caspase3/cpp32比色化验试剂盒细胞测定裂解物caspase 3活性,改进的ELISA法检测p53总量和相对活性吸光度。shRNA表达载体pXi-1、pXi-2和pXi-3转染HepG2-pCEP4-X后再次分析细胞凋亡比、细胞周期、caspase 3活性以及p53表达和活性。 结果:从质粒pEcob6成功PCR扩增出HBV X全基因并克隆至质粒pEasy、pCEP4和pcDNA3.1(+),酶切、PCR及测序均证实真核表达载体质粒pCEP4-X和pcDNA3.1(+)-X构建成功。转染后成功筛选出耐Hygromycin或Neomycin的阳性细胞克隆,并能传代培养。PCR、RT-PCR和Western Blot鉴定证实HBX表达。shRNA表达载体pXi-1、pXi-2和pXi-3转染至HepG2-pCEP4-X后RT-PCR和Western Blot分析表明序列特异性pXi-1、pXi-2能显著抑制HBX的表达,而序列无关对照pXi-3则对HBX的表达水平无影响。2.0μmol/L As2O3作用36 小时后细胞凋亡比明显增高,但shRNA表达质粒转染过程也可使细胞凋亡比增高。不同HBX表达水平的细胞组As2O3作用后细胞凋亡比有统计学差异(P<0.05),HBX表达后凋亡比下降,序列特异性RNAi抑制HBX表达后凋亡比可再次增高。2.0μmol/L As2O3作用36小时后G1期细胞减少(P<0.01),G2/M期细胞增多(P<0.01)。但不同HBX表达水平的细胞As2O3作用后G1期、G2/M期和S期细胞构成均无统计学差异。各处理组细胞裂解物反映caspase3活性的405nmOD值有统计学差异(P<0.01),但是否予As2O3对同种细胞的caspase3活性无统计学影响(P>0.05),而不同HBX表达水平的细胞As2O3作用后caspase3活性却有统计学差异(P<0.01)。表达HBX的细胞caspase 3活性下降,特异性shRNA抑制HBX表达后caspase3活性可再次增高。As2O3作用使HepG2和HepG2-pCEP4-X细胞p53蛋白水平上调和p53相对活性比增强。表达HBX后As2O3诱导的p53蛋白水平有所上调,但显著抑制p53相对活性,shRNA 抑制HBX 的表达后其对p53的活性抑制得以解除。 结论: 1.成功构建不同筛选特性的两个HBX基因真核表达载体。 2.成功构建两个不同筛选特性的表达HBX基因的HepG2-X细胞模型。 3.特异性的shRNA能抑制HepG2-pCEP4-X的HBX基因表达。 4.2.0umol/L As2O3作用HepG2细胞36小时后可诱导细胞凋亡,并使细胞阻滞于G2/M期,但该作用是否与caspase3活性相关需进一步研究。 5.As2O3作用后,HepG2-pCEP4-X细胞的细胞凋亡比和caspase 3活性均比HepG2细胞低,shRNA抑制HBX表达后则可使统计学差异消失,但这种效应与细胞周期无关。 6.As2O3使HepG2细胞p53表达上调和活性增强。 7.HBX表达可能上调As2O3诱导的p53蛋白水平,但显著抑制p53的结合与转录调节活性,shRNA抑制HBX表达后则无此效应。
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