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GPI-PLD基因表达水平对CML白血病细胞免疫清除的影响
中文名称: GPI-PLD基因表达水平对CML白血病细胞免疫清除的影响
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论文编号: 3101606收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Effect of GPI-PLD Gene Expression Levels on Immune System to Cleanse of Leukemic Cells from CML
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 病理学与病理生理学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白质 GPI特异性磷脂酶D 慢性粒细胞白血病 转基因 肿瘤免疫 细胞活化 基因表达水平
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论文简介:研究背景:糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚定蛋白质是真核生物细胞质膜上非常重要的一类膜蛋白。GPI特异性磷脂酶D(GPI-PLD)能选择性地水解GPI锚定蛋白质中的肌醇磷酸酯键,释放出锚定蛋白,影响GPI锚定蛋白质的表达和生物学功能。该酶活性可受多种因素,包括脂多糖、氧化剂、葡萄糖和胰岛素等的影响和调控。肝脏、胰腺和骨髓是人血浆GPI-PLD的重要来源。本课题组已经从人骨髓基质细胞中克隆出GPI-PLD完整cDNA(长度2.6kb,GenBank accession number AY007546),这为进一步研究GPI-PLD创造了条件。GPI锚定蛋白质如CD55、CD59等是重要的免疫分子,T淋巴细胞的活化和增殖也涉及到富含GPI锚定蛋白、胆固醇、鞘糖脂、G蛋白和PTK的脂微区来实现信号转导。GPI锚定蛋白质结构的完整性对其发挥生理活性很重要,例如GPI锚定的CD55、CD59水解成可溶形式后,水溶性CD59的功能就不完全,抑制补体的能力下降。慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是造血组织的一种恶性肿瘤,其白血病细胞BCR-ABL融合基因表达的产物属src基因家族,具有PTK激酶活性。已经有报道提示白血病细胞的某些GPI锚定蛋白质的表达和功能都可能存在异常。对一些白血病细胞株如K562、HL-60、U937等检测发现,它们均可表达GPI-PLD,但其表达水平都非常低,而且不同细胞株表达的水平有差异。因此,白血病细胞中GPI锚定蛋白和GPI-PLD水平变化与白血病的发生和发展可能有一定的联系。为了研究CML患者GPI-PLD和GPI锚定CD55、CD59的表达水平以及它们之间的关系,GPI-PLD和GPI锚定蛋白质在CML发病中可能的分子机制,白血病K562细胞株的GPI-PLD活性和表达水平是否会影响到免疫系统对它的杀伤作用,以及GPI-PLD与肿瘤免疫逃逸是否有密切联系,研究者设计本实验,初步探讨和解决这些问题。 方法: 1.应用竞争性定量RT-PCR技术确定正常人和CML患者外周血单个核细胞中GPI-PLD mRNA的表达水平,采用我室自制的具完整GPI结构的胎盘型碱性磷酸酶(PLAP)作底物测定正常人和CML患者GPI-PLD的酶活性,流式细胞术分析外周血单个核细胞表面GPI锚定CD55和CD59的表达水平,Western-Blotting结合TX-114分相技术检测GPI-PLD对GPI锚定CD55和CD59的释放。 2.采用基因克隆技术构建GPI-PLD cDNA真核表达载体,脂质体转染K562细胞,G418筛选稳定转染、过度表达GPI-PLD的阳性克隆细胞株,通过检测GPI-PLD mRNA的表达水平和酶活性以及对GPI锚定CD55和CD59的释放,确定基因转染是否成功。 3.用胰岛素作为诱导剂分别对野生型K562细胞株和稳定转染GPI-PLD基因阳性克隆的K562细胞株进行诱导试验,观测GPI-PLDmRNA的表达水平、酶活性和GPI锚定CD55、CD59的释放变化。 4.台盼蓝排斥法观测K562细胞GPI-PLD水平改变对补体介导的细胞毒作用的杀伤率变化,MTT比色法判断T淋巴细胞对K562细胞在不同GPI-PLD水平时的杀伤率。 结果: 1.检测110名正常人和80例CML患者,发现CML患者外周血单个核细胞和血浆中GPI-PLD活性水平(均以释放GPI锚定的PLAP的百分率表示)的平均值(x±s)为21.2±2.8%与28.9±3.6%,显著性低于正常人的水平(相应为41.7±3.8%和41.9±4.5%),其单个核细胞和血浆中酶活性水平减少的幅度分别为100%和70%(P<0.001)。进一步分析发现,CML患者单个核细胞GPI-PLD活性仅为其血浆中酶活性水平的75%(P<0.001),但正常人单个核细胞和血浆中GPI-PLD酶活性水平无显著性差异(P<0.05). 2.竞争性定量RT-PCR方法检测20名正常人和20例CML患者的GPI-PLD mRNA 的表达水平。结果表明,正常人和CML患者外周血单个核细胞GPI-PLD mRNA表达水平的平均值(x±s)相应为1.237×10<'3>±42拷贝/ng 总RNA和0.438×10<'3>±30拷贝/ng总RNA,正常人GPI-PLD mRNA表达水平显著性高于CML患者(P<0.001),大约为其3倍。其中6例CML患者经骨髓移植治疗成功后,GPI-PLD活性和mRNA表达水平均基本恢复至正常人的水平。 3.流式细胞术分析20名正常人和40例CML患者,发现其外周血单个核细胞GPI锚定CD55和CD59分子均显示阳性,但其荧光强度的数值范围正常人较CML患者要弥散一些。正常人CD55和CD59分子的荧光强度值范围相应在330.7至673.8和545.6到782.4;CML患者其数值范围相应在438.8至478.6和641.2到704.6;CML患者单个核细胞表面CD55和CD59表达水平的平均值(x±s)相应为537.2±25与747.9±35,正常人相应为458.0±13与677.4±19,CML患者这两种分子的表达水平都显著性高于正常人(P<0.05)。 4.成功构建了GPI-PLD cDNA的真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)/GPI-PLD,筛选到了稳定高表达GPI-PLD活性的K562细胞株。阳性克隆细胞株的GPI-PLD活性和mRNA表达水平比阴性包括空载体阳性对照组K562细胞都相应提高了约6和7倍,功能鉴定还显示阳性克隆细胞表面的GPI锚定CD55和CD59分子数量均显著性减少,仅为对照组的一半。 5.用10<'-7>mol/L浓度的胰岛素诱导野生型K562细胞株24h和48h,可导致诱导细胞的GPI-PLD mRNA表达水平和GPI-PLD活性水平同步增高4倍和7倍;诱导稳定转染型K562细胞株24h和48h,可使它们在原有高表达水平上再增高约10%和20%。 6.Western-Blotting结合TX-114分相技术检测野生型K562细胞和稳定转染型K562细胞,经胰岛素诱导后,发现其细胞内的GPI-PLD活性水平不同,保留在细胞膜上的GPI锚定型CD55和CD59的量,以及出现于细胞培养液中的水溶性CD55和CD59的量也不同,这证明释放反应由GPI-PLD催化实现。 7.胰岛素诱导24 h和48 h后,野生型K562细胞的补体杀伤率由诱导前的6.44±0.22%显著性增高到12.19±0.14%和18.79±0.4296,增高的百分率分别为189%和293%;阳性克隆K562细胞经胰岛素诱导24h和48h后,其补体杀伤率也在原有高杀伤率(18.40±0.41%)基础上显著性增高到20.87±0.70%和25.28±0.26%,增高的百分率分别为112%和137%。而且,GPI-PLD酶活性与补体介导的细胞毒杀伤率成正相关,相关系数为0.975。 8.胰岛素诱导24 h和48 h后,野生型K562细胞被T淋巴细胞的杀伤率由诱导前的8.45±0.32%显著性增高到26.77±0.37%和32.70±0.43%,增高的百分率分别为316%和507%;阳性克隆K562细胞经胰岛素诱导24h和48h后,其T淋巴细胞杀伤率也在原有高杀伤率(36.81±0.31%)基础上显著性增高到43.72±0.12%和49.30±0.28%,增高的百分率分别为119%和133%。GPI-PLD酶活性与T淋巴细胞的杀伤率也成正相关,相关系数为0.959。 结论: 1.首次报道CML患者白血病细胞GPI-PLD活性和表达水平比正常人显著性减少,经骨髓移植治疗成功后,两者可恢复至正常人的水平;白血病细胞膜上GPI-PLD活性低下可导致细胞表面GPI锚定CD55和CD59的数目显著性增加。 2.首次成功建立稳定高表达GPI-PLD cDNA的白血病K562细胞株。 3.发现胰岛素诱导K562细胞株可导致GPI-PLD基因过度表达及GPI-PLD活性显著性增加,与此同时,细胞表面GPI锚定CD55和CD59的分子数量均显著性减少,细胞被补体和T淋巴细胞的杀伤率都相应增加。 4.首次阐述和证实GPI-PLD参与了CML发病的分子机制,它与肿瘤的免疫逃逸也密切相关。
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