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RNA干扰沉默CTGF对人成骨样MG63细胞基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-2表达的影响
中文名称: RNA干扰沉默CTGF对人成骨样MG63细胞基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-2表达的影响
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论文编号: 3101585收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: The Effects of Silencing Connective Tissue Growth Factor on the Expression of Matrix Metalloproteinase-1 and -2 in Human Osteoblastic MG63 Cells
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 内科学内分泌代谢病
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: RNA干扰 CTGF 人成骨样MG63细胞 MMP-1 MMP-2 重组人结缔组织生长因子 成骨细胞 增殖 护骨素 核因子κB受体活化配体 膜型基质金属蛋白酶-1 基质金属蛋白酶-2
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论文简介:第一部分RNA干扰沉默CTGF对人成骨样MGG63细胞基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-2表达的影响。 目的:我们以前的研究发现,雌二醇可下调人成骨样MG63细胞CTGF的表达,但人成骨样MG63细胞CTGF表达下调所引起的生物学效应尚不清楚。本研究用RNA干扰技术,阻断CTGF在人成骨样MG63细胞中的表达,观察CTGF降表达后对人成骨样MG63细胞Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-2表达的影响。并观察抑制CTGF的内源性的表达对人成骨样MG63细胞活力的影响。 方法:针对人CTGF mRNA 440、875、910位点设计、合成三对21核苷酸siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3);在阳离子脂质体介导下转染人成骨样MG63细胞,以空白及非特异性siRNA作为对照,转染48h后收集细胞。采用Northern杂交观察CTGF mRNA表达水平的改变,半定量RT—PCR观察Ⅰ型胶原、ALP、MMP-1、MMP-2 mRNA表达的改变,western blotting观察CTGF、MMP-1、MMP-2蛋白表达的变化。MTT法测定RNA干扰后人成骨样MG63细胞活力。 结果:体外转录合成的siRNAl(对应于440位点)、siRNA3(对应于910位点)转染人成骨样MG63细胞后,能抑制CTGF mRNA和蛋白的表达,其中siRNAl的抑制作用更为显著,可将CTGF蛋白抑制达70%以上,siRNA2(对应于875位点)对人成骨样MG63细胞CTGF的表达无明显作用;在siRNA1、siRNA3组,随CTGF表达下调,成骨细胞的Ⅰ型胶原、ALP mRNA表达明显下调,而在siRNA2组Ⅰ型胶原、ALP mRNA表达则无明显变化;在siRNA1、siRNA3组,随CTGF表达下调,MMP-1mRNA和蛋白表达明显下调,而MMP-2 mRNA、蛋白表达均无明显变化。此外,我们还观察到,CTGF表达下调使siRNA1组和siRNA3组的人成骨样MG63细胞存活率显著降低。 结论:CTGF表达下调可抑制MG63细胞Ⅰ型胶原、ALP、MMP-1mRNA的表达,下调MMP-1蛋白的表达,降低MG63细胞活力,但对MMP-2 mRNA及蛋白表达无明显变化。说明CTGF是维持人成骨样MG63细胞存活、正常分化所必需的细胞因子;CTGF可能通过调节基质金属蛋白酶的表达在维持骨代谢平衡中发挥重要的作用。 第二部分重组人结缔组织生长因子对人成骨细胞增殖、分化及凋亡的影响。 目的:研究重组人结缔组织生长因子(recombinant human connective tissue growth factor rCTGF)对人成骨细胞增殖、分化及凋亡的影响。 方法:用rCTGF干预体外培养的人成骨细胞,采用<'3>H-TdR掺入法检测人成骨细胞增殖率,α-磷酸萘酚法测定细胞内碱性磷酸酶活性变化,放免法测定骨钙素含量的变化,western blotting检测Ⅰ型胶原表达的变化,应用流式细胞仪检测rCTGF对成骨细胞凋亡的影响;采用荧光染料吖啶橙和溴化乙锭染色,激光共聚焦显微镜观察rCTGF对细胞凋亡的影响。 结果: rCTGF呈剂量依赖性促进人成骨细胞增殖,200ng/mL rCTGF达最大促增殖效应;rCTGF干预显著促进人成骨细胞分化,rCTGF呈剂量依赖性增加Ⅰ型胶原、骨钙素表达及碱性磷酸酶活性;rCTGF干预可无血清诱导的成骨细胞凋亡减少48%,激光共聚焦显微镜观察结'果显示200ng/mL rCTGF干预组凋亡细胞数明显减少。 结论:rCTGF可显著促进人成骨细胞的增殖和分化,并抑制人成骨细胞凋亡。CTGF通过增加成骨细胞的数量、增加骨基质的合成,具有刺激骨形成的作用。因为rCTGF仅含成熟CTGF C-末端结构域,所以CTGF主要通过其C-末端结合区发挥促进人成骨细胞增殖、分化的生物学效应。 第三部分重组人结缔组织生长因子对人成骨细胞护骨素/核因子K B受体活化配体表达的影响。 目的:研究重组人结缔组织生长因子(recombinant human connective tissue growth factor rCTGF)对体外培养的人成骨细胞护骨素/核因子kB受体活化配体表达的影响,探讨结缔组织生长因子调节护骨素/核因子kB受体活化配体表达的信号转导机制。 方法:用重组人结缔组织生长因子干预体外培养的人成骨细胞,采用 western blotting检测护骨素/核因子kB受体活化配体蛋白表达水平的变化,同时观察重组结缔组织织生长因子对人成骨细胞焦点黏附酶(focal adhesion kinase FAK)、丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase MAPK)及AKT磷酸化的影响。 结果: rCTGF可呈时间一剂量依赖性地抑制人成骨细胞RANKL的表达,200ng/ml CTGF作用24~48h达最大抑制效果,而对人成骨细胞OPG的表达无明显影响。rCTGF可明显增强p38-MAPK磷酸化,并减少FAK磷酸化,rCTGF干预对p42/44 MAPK、JNK及AKT磷酸化无明显影响;p38-MAPK阻断剂SB 23058可阻断rCTGF对RANKL表达的抑制效应。 结论: rCTGF通过增强p38-MAPK磷酸化,减少FAK磷酸化,下调人成骨细胞RANKL的表达。CTGF通过降低人成骨细胞RANKL的表达,可抑制破骨细胞的形成,从而有助于骨代谢平衡的维持。 第四部分重组人结缔组织生长因子对人成骨细胞膜型基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-2表达的影响。 目的:研究重组人结缔组织生长因子(recombinant human connective tissue growth factor rCTGF)对体外培养的人成骨细胞膜型基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-2表达的影响,并探讨结缔组织生长因子调节膜型基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-2表达的信号转导机制。 方法:用重组人结缔组织生长因子干预体外培养的人成骨细胞,采用 westem blotting检测膜型基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-2蛋白表达水平的变化,同时观察重组结缔组织织生长因子对人成骨细胞MAPK及AKT磷酸化的影响。 结果: rCTGF可呈时间-剂量依赖性地促进人成骨细胞膜型基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-2的表达,200ng/mlCTGF作用24~48h达最大效果。rCTGF可明显增强p38-MAPK磷酸化,p38-MAPK阻断剂SB 23058可阻断rCTGF上调膜型基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶一2的效应。 结论: rCTGF通过活化p38-MAPK,上调人成骨细胞膜型基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-2的表达。
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