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依地福新抑制粟酒裂殖酵母细胞胞质分裂机制的研究
中文名称: 依地福新抑制粟酒裂殖酵母细胞胞质分裂机制的研究
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论文编号: 3101531收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Experimental Studies on Possible Pharmacological Mechanism of Edelfosine Inhibiting Cytokinesis of S.pombe
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 药理学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 依地福新 粟酒裂殖酵母 胞质分裂 Jurkat细肥 mid2 spm1 pmp1 基因表达 MAPK级联
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论文简介:第一章依地福新对粟酒裂殖酵母细胞胞质分裂的影响 【背景与目的】依地福新为人工合成的抗肿瘤醚酯类药物,它能抑制肿瘤细胞分裂,但并不抑制核的裂解,导致细胞聚集在G<,2>/M期,形成多核细胞,随后通过凋亡促使细胞死亡。也有报告指出,依地福新处理过的细胞能经历完全的细胞周期,但不能进行分裂,使细胞聚集在G<,0>/G<,1>期,形成四倍体或八倍体细胞。然而,依地福新抑制肿瘤细胞的胞质分裂的机制仍然不清楚。人体细胞与酵母细胞在生长周期存在着相似性。许多有关人体细胞的研究成果都是首先通过研究酵母细胞发现的。癌症细胞本质上来源于机体正常细胞。由于在细胞分裂的不同阶段受各种因素的影响,导致其出现分化和增殖的异常,从而使人们在利用癌细胞进行有关研究时带来许多困难。而以粟酒裂殖酵母作为研究对象,易于进行细胞学操作、具有明显的细胞周期,且生长迅速、易于培养。因此本研究以粟酒裂殖酵母作为实验材料,探讨依地福新(edelfosine)抑制粟酒裂殖酵母(S.pombe)细胞生长的作用剂量,及在此作用剂量下,依地福新对粟酒裂殖酵母细胞胞质分裂和胞核分裂的影响。 【方法】 ⒈应用粟酒裂殖酵母细胞和Jurkat细胞的生长抑制试验,确定依地福新抑制粟酒裂殖酵母细胞生长的作用剂量。 ⒉利用粟酒裂殖酵母细胞胞质分裂抑制试验,观察依地福新对粟酒裂殖酵母细胞胞质分裂的影响。 ⒊利用粟酒裂殖酵母细胞胞核分裂试验和粟酒裂殖酵母DNA含量检测试验,观察依地福新对粟酒裂殖酵母细胞胞核分裂的影响。 【结论】 ⒈1.0μM-5.0μM浓度的依地福新能抑制粟酒裂殖酵母和Jurkat细胞生长,对粟酒裂殖酵母具有与其抗肿瘤细胞相似作用。 ⒉0.5μM-1.5μM浓度的依地福新依地福新抑制粟酒裂殖酵母细胞的胞质分裂,但不影响细胞核DNA的合成和胞核的分离。 第二章依地福新对粟酒裂殖酵母胞质分裂突变体mid2△、spml△和propl△生长的影响 【背景与目的】有报道指出,依地福新在其凋亡浓度(5-25μM)时,可抑制MAPK/ERK促有丝分裂途径和Akt/PKB(蛋白激酶B)生存途径。在粟酒裂殖酵母细胞人们已经发现了多条MAPK级联,其中Mkh1(MEKK)-Skhl/Pekl(MEK)-Spml/Pmkl(MAPK)细胞信号途径与细胞形态发生有关。 Mkhl(MEKK)-Skhl/Pekl(MEK)-Spml/Pmkl(MAPK)细胞信号途径通过细胞膜上的Mid2接受细胞外信号后,经小GTP酶Rh04激活PKC<,1>-MPK<,1>细胞完整性通路,使Spml磷酸化程度增加,最终激活Spml;而Pmpl能抑制Spml的磷酸化,使Spml的磷酸化程度降低。spml基因,也称之为pmkl,它的系统命名为SPBCl 19.08,编码生成的蛋白为MAP激酶Spml/Pmkl(MAP kinase Spml/Pmkl,MAPK<'spml/Pmkl>);pmpl基因的系统命名为 SPBCl685.01,它编码生成的蛋白为双重特异的MAPK磷酸酶Pmpl,Pmpl参与MAPKKK级联反应(MAPKKK cascade),与细胞裂殖时的信息传递有关,具有使蛋白氨基酸脱磷酸化作用,能影响Spml蛋白磷酸化;mid2基因的系统命名为SPAPYUG7.03c,它编码生成的蛋白为香兰素同系物 Mid2(anillin homologue Mid2),Mid2影响裂殖酵母细胞隔膜的组装 (organization)和解聚(disassembly),它参与胞质分裂时的细胞分离过程。为了验证依地福新对Mkhl(MEKK)-Skhl/Pekl(MEK)-Spml/Pmkl(MAPK)信号级联的影响,需要判断出依地福新抑制胞质分裂是否与mid2、spml和pmpl基因有关。其方法是利用这些细胞的突变体。这些突变体由于基因突变,而被封阻在细胞周期的某一特定阶段,从而得知此突变的基因是与该特定阶段的调控有关的基因。本实验以胞质分裂突变体mid2△、spml△和pmpl△为实验材料,探讨依地福新对MAPK级联信号相关基因的影响,从而阐明依地福新抑制胞质分裂的机制。 【方法】应用粟酒裂殖酵母细胞突变体生长抑制试验,观察依地福新对野生型粟酒裂殖酵母细胞和mid2突变体(mid2△)、spml突变体(spml△)、pmpl突变体(pmpl△)生长率的影响。 【结论】spml、mid2和pmpl基因突变后对依地福新的抗性增强。因此,依地福新抑制粟酒裂殖酵母胞质分裂可能与MAPK级联相关的mid2、pmpl、spml基因有关。 第三章spml、pmpl和mid2基因在相应粟酒裂殖酵母突变体中的再表达 【背景与目的】利用酵母突变体及其同源基因再表达的功能互补实验,是目前遗传学和分子生物学研究的一种重要实验方法,并使酵母成为筛查药物作用机制的工具。通过使用药物对特定的酵母基因突变株进行干预,筛选出对药物敏感或抵抗的突变株,然后利用酵母基因重组技术,使突变株再表达同源的基因,从而获得再表达同一基因的克隆。如果构建的同源克隆酵母可以挽救此突变株对药物的敏感性或抵抗性,那么就说明药物可能影响此基因。这将成为一种筛选抗癌和抗病毒药物的分析系统。因此,将spml、pmpl和mid2基因在相应粟酒裂殖酵母突变株中进行再表达,观察其是否能恢复对依地福新的敏感性,可确定依地福新对这些基因是否产生影响。本实验的目的是,将粟酒裂殖酵母细胞胞质分裂相关基因spml、pmpl和mid2在相应突变株中进行再表达,并筛选出有表达活性的重组子。 【方法】 ⒈应用TRIZOL试剂法抽提粟酒裂殖酵母细胞的RNA; ⒉反转录:PCR(RT-PCR)制备粟酒裂殖酵母细胞的cDNA; ⒊应用PCR扩增spml、pmpl和mid2基因; ⒋将spml、pmpl和mid2基因克隆到pREP3X-HA质粒中; ⒌将pREP3X—HA—spml、pREP3X-HA-pmpl和pREP3X—HA—mid2电转化到粟酒裂殖酵母突变体spml△、pmpl△和mid2A细胞中; ⒍应用硫胺素抑制试验筛选活性的pREP3X—HA—spml、pREP3X—HA-pmpl和pREP3X—HA—mid2重组酵母。 【结论】pREP3X-HA-spml穿梭载体、pREP3X-HA-pmpl穿梭载体和pREP3X-HA。mid2穿梭载体成功转入到相应的突变体细胞中,且转化子具有表达活性。 第四章依地福新影响粟酒裂殖酵母MAP激酶Spml的磷酸化 【背景与目的】蛋白激酶级联调节胞质和胞核对细胞外刺激的应答。MAPK(丝裂原激活的蛋白激酶)级联是在单细胞和多细胞真核生物中发现的古老而保守的蛋白激酶级联。在粟酒裂殖酵母(S.pombe)细胞人们目前也已经发现了多条MAPK级联,其中Mkhl(MEKK)-Skhl/Pekl(MEK)-Spml/Pmkl(MAPK)细胞信号途径与细胞形态发生有关。在粟酒裂殖酵母细胞中,细胞胞膜上的Mid2接受细胞外信号后,经GTPase Rho4激活PKC<,1>-MPK<,1>细胞完整性通路,信号经Mkhl(MEKK)-Skhl/Pekl(MEK)-Spml/Pmkl(MAPK)途径传递,最终影响细胞形态的发生。而Pmpl在体外能直接去除Spml/Pmkl酪氨酸残基上的磷酸,导致Spml/Pmkl去磷酸化;Pmpl在体内也能影响Spml/Pmkl中酪氨酸的磷酸化。因此,本实验的目的是探讨依地福新对经:Mid2介导的,Pmpl抑制的MAPK Spml信号通路的影响,以阐明依地福新抑制粟酒裂殖酵母细胞胞质分裂的作用机制。 【方法】 ⒈通过野生型粟酒裂殖酵母和胞质分裂突变体spml△、pmpl△、mid2△及其再转化株对依地福新的平行生长抵抗试验,进一步确定依地福新对spml、pmpl、mid2基因的影响; ⒉应用依地福新对Spml磷酸化的影响试验,阐明依地福新是否通过影响Mid2蛋白和Pmpl蛋白的表达而影响Spml蛋白的磷酸化。 【结论】 ⒈依地福新通过影响粟酒裂殖酵母细胞mid2、spml和pmpl基因而抑制粟酒裂殖酵母细胞的胞质分裂。 ⒉细胞外依地福新诱导Mid2蛋白的表达,从而促进的Spml磷酸化;细胞内依地福新通过抑制Pmpl蛋白的表达,取消Pmpl蛋白对Spml的抑制作用,使Spml的磷酸化程度增加,最终导致粟酒裂殖酵母细胞胞质分裂障碍。
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