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日本血吸虫童虫细胞诱导小鼠抗攻击感染的免疫学研究
中文名称: 日本血吸虫童虫细胞诱导小鼠抗攻击感染的免疫学研究
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论文编号: 3101522收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Immunological Research on Protection Against Challege Infection Induced by Schistosomulum Cells in Mouse Model
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 病原生物学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 日本血吸虫 童虫 虫源性细胞 保护性免疫 IgG2a 培养细胞 被动转移 体外杀伤 IFN-γ IgG ELISA 噬菌体随机十二肽库
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论文简介:第一篇日本血吸虫童虫虫源性细胞免疫小鼠诱生的保护性效果 【目的】在前期研究中发现,用日本血吸虫(Sj)童虫的虫源性活细胞可诱导小鼠产生较明显的抗攻击感染保护性免疫。本研究目的是为了进一步确认其免疫效果;比较童虫细胞和成虫细胞,死细胞与活细胞诱导宿主所产生的保护性效果差异及其免疫应答特点;探索最佳的免疫次数。 【方法】S.j尾蚴感染小鼠获得虫体。胰酶消化法制备虫源性细胞。台盼蓝染色检测细胞活率。活细胞经-20℃冻融后定为死细胞。PCR扩增鉴定血吸虫虫源性细胞的种属特异性并检测细胞的纯度。本研究设计了两个实验方案。在实验一中,53只昆明小鼠被分成4组,即对照组10只、18天童虫活细胞(LLC)免疫组18只、18天童虫死细胞(DLC)免疫组13只和42天成虫死细胞(DAC)免疫组11只。每两周分别用各免疫原对小鼠作皮下注射,共4次。于末次免疫后1周用30±1 S.j尾蚴对小鼠进行攻击感染。感染后第42天剖杀冲虫,观察结果。根据实验1结果,LLC是诱导小鼠产生最佳保护性效果的免疫原,因此,在实验二中选择了LLC对昆明小鼠作不同次数免疫,比较所诱导产生的保护性免疫,探索最佳免疫次数。28只小鼠随机分为4组:免疫1次组(V1)、2次组(V2)和3次组(V3)及对照组(Co)。于末次免疫后第2周用30±1 S.j尾蚴进行攻击感染。感染后第45天解剖小鼠冲虫。保护性效果的观察指标包括:计数虫荷及卵荷;测量虫体长度和肝组织内虫卵肉芽肿面积;对虫卵肉芽肿进行组织病理学观察。免疫学观察指标包括:ELISA检测免疫前后不同时点鼠血清中特异性总抗体(IgG+A+M)和IgG亚类抗体水平的动态变化;用SDS-PAGE及Western-blot对虫体与细胞的成分差异及免疫特性差异进行比较分析。 【结论】本研究表明:来源于18天童虫的活细胞可诱导昆明鼠产生较理想的免疫保护效果;免疫2次或3次的保护性效果无显著差异;IgG亚类绝对水平增高及IgG2a/IgG1比值增高间接反映了Th1型免疫反应与保护性免疫呈正相关;用于免疫接种的细胞源于虫体实质成分,其中38kDa组分可能是一种优势抗原分子,但对其性质与功能有待于进一步研究。 第二篇日本血吸虫童虫培养细胞免疫小鼠诱导的保护性效果 【目的】前文研究证明,日本血吸虫(Sj)童虫源性细胞免疫小鼠可获得较为满意的抗攻击感染效果。基于本课题组在Sj细胞体外传代培养技术突破,本研究拟用Sj体外培养细胞为免疫原,观察其诱导昆明小鼠所产生的免疫保护性效果以及免疫应答类型,以探索研发此类疫苗的可能性。 【方法】获取Sj尾蚴感染小鼠后不同发育期虫体,在无菌条件下制备虫源性细胞,用PRIM-1640-40sj特定培基进行体外原代和传代培养。用台盼蓝染色鉴定细胞活率。PCR扩增鉴定传代培养细胞的种属特异性并检测细胞的纯度。通过两组实验观察传代培养细胞所诱导的保护性效果及免疫反应类型。在实验一中,3组小鼠每组8只,按1次/两周间隔经腹腔分别注射生理盐水(NSCo),18天童虫培养细胞(JC-18)及12天童虫培养细胞(JC-12),共进行3次免疫。末次接种后第2周用40±2尾/鼠的Sj尾蚴攻击感染。感染后第42天剖杀冲虫,观察保护性效果。在实验二中,根据实验1结果(发现JC-12的保护效果优于JC-18),进一步比较了体外培养的12天童虫细胞(JC-12)和30天成虫细胞(AC-30)所诱导的免疫保护性差异。在本实验中,设计了两个接种途径:腹膜内注射(ip)和腹股沟皮下注射(sc)。JCip,JCsc,ACsc和ACip 4个免疫组,每组10只,按1次/两周的接种间隔共免疫3次。10只对照组小鼠(co)皮下注射D’hanks组。各组小鼠于末次免疫后第4周用30±1尾/鼠Sj尾蚴进行攻击感染,感染后第40天剖杀冲虫,观察了所诱导的保护性效果及免疫应答类型。用SDS-PAGE和Western-blot对成虫(AWA),童虫(JWA)和童虫培养细胞(JCA)的蛋白组分进行了分析。用JC-12和AC-30免疫鼠及对照鼠的脾细胞和血清分别对预感染Sj尾蚴(50尾±5/鼠)后第5天的小鼠作腹腔注射1次(血清:0.2ml/鼠,脾细胞:4.5×10<'6>/鼠),每组6只鼠。被动免疫后第35天剖杀冲虫,观察了所诱导的保护性效果及免疫反应类型。用免疫鼠脾细胞与Sj尾蚴于体外共同培养,观察24h,48h和72h的虫体死亡率。检测经相应抗原刺激后的免疫鼠和非免疫鼠脾细胞分泌的LI-4和IFN-γ水平。 【结论】用体外培养的童虫细胞免疫昆明小鼠可诱导产生抗血吸虫攻击感染的保护性效果,但JC-18所诱生的免疫效果不如JC-12,提示可能越幼期的虫体细胞诱生的保护性效果越好。与前文比较,18天童虫虫源性细胞免疫所获得效果优于18天童虫培养细胞,其原因可能与实验批间差异或与细胞经培养后某些成分被丢失有关。实验1和实验2的免疫效果有明显差异,这可能与免疫源制备的稳定性或实验批间差异有关。在有效免疫中,显示出以Th1型为主的免疫应答机制,但结合体外试验结果可发现,高水平的保护性效果可能与Th1型和Th2型协同免疫所发挥的作用相关。成虫培养细胞不能诱生抗攻击感染作用的原因以及早期童虫细胞免疫接种的最佳方案还有待于进一步探索。 第三篇日本血吸虫细胞型免疫原模拟表位的筛选及鉴定 【目的】根据前述研究中证明S.j童虫细胞可在小鼠动物模型中诱导产生有效的抗感染免疫。本研究为了从分子水平了解此类免疫原的保护性机制,采用噬菌体展示技术对Sj童虫细胞抗原模拟肽表位进行了免疫筛选与鉴定。 【方法】S,j12天童虫细胞经体外培养至4代后,用其活细胞免疫接种昆明小鼠,收集经保护性实验证明有效的攻击感染前免疫血清,用饱和硫酸胺沉淀法初纯化IgG抗体(抗SjJC-12抗体)后对噬菌体随机12肽库进行免疫筛选。经过4轮免疫淘洗,阳性克隆得到16250倍有效富集。从第4轮筛选结果中随机挑选20个克隆,经ELISA检测鉴定出15个阳性克隆;通过DNA测序和生物信息学分析出12个不同序列的阳性克隆。将此12个克隆分别免疫小鼠制备抗血清。用ELISA鉴定12个克隆的免疫原性以及是否为血吸虫细胞的免疫模拟表位。用8个含精氨酸残基的克隆和4个不含精氨酸残基的克隆分别对昆明鼠进行联合免疫(1次/10d,共3次),于末次免疫后两周用24尾/鼠S.j尾蚴进行攻击感染,观察保护性效果。 【结论】用抗JC-12抗体对噬菌体随机12肽库进行免疫筛选得到12个不同序列的克隆(含精氨酸残基的8个);经鉴定显示,有11个免疫宿主产生抗体应答,用JWA检出10个克隆免疫血清呈阳性反应,其中两个克隆具有进一步研究的价值。
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