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消膏转浊法逆转肥胖型非酒精性脂肪肝模型大鼠肝脏脂肪变性的实验研究
中文名称: 消膏转浊法逆转肥胖型非酒精性脂肪肝模型大鼠肝脏脂肪变性的实验研究
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论文编号: 3101296收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: 无英文名称
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 中医内科
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 大鼠 肥胖 非酒精性脂肪肝 消膏转浊方 胰岛素抵抗 脂质过氧化反应 中医药治疗
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论文简介:目的:非酒精性脂肪肝是一种无过量饮酒史,以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。随着人民生活水平的提高,非酒精性脂肪性肝炎(nonacohoficsteatohepatitis,NASH)发病逐渐增多。其中,病因与肥胖密切相关,且有年轻化的趋势,在肥胖症患者中发病率则高达60%~90%;肥胖儿童可达80.49%。目前普遍认为NASH不再是良性病变,约25%可以发展为肝纤维化、8%可进展为肝硬化而导致一系列严重并发症,不少学者认为NASH是隐源性肝硬化或非活动性小结节性肝硬化的前期病变。因此已成为全球普遍关注的医学问题和社会问题。NASH尚无理想的防治药物。中医在防治NASH方面具有一定的优势。导师仝小林教授认为:肥胖是非酒精性脂肪肝、2型糖尿病、血脂异常、高血压、冠心病等诸多疾病的“共同土壤”,乃一因多病。从“膏”、“浊”论治肥胖及其相关疾病可使防治重心大大前移,体现了从源头控制,“未病先防、既病防变”的思想。肥胖型非酒精性脂肪肝前期主要病因是肥胖。多与饮食不节、久坐少动、情志失和、先天禀赋异常及脏腑功能失调有关。病机多为肝郁脾滞,中焦大气不转,气机升降受阻,木郁土壅,致津液失调,精微物质不归正化,酿脂为膏,异位沉积于肝内,阻滞肝络,而成脂肪肝。膏浊与气滞并见,气血运行不畅,而瘀血内生,浊瘀交阻,积结肝内,久而化毒。治疗上,则应治其根本,从消膏转浊立法;病程已久,膏浊未尽,瘀滞之象渐露,则应加强化瘀方药的应用,故立法为消膏、转浊、祛瘀、排毒。临床使用消膏转浊方治疗肥胖型非酒精性脂肪肝取得较好疗效。本课题采用国内外公认的研究模型,结合NASH的现代研究成果,用病理学、生物化学、免疫组化、分子生物学等技术,观察非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏组织学特点、肝功、血脂、血糖、胰岛素及肝匀浆中FFA、MDA、SOD、TNF-α和Leptin的变化情况,以及CYP2E1、:InsR和IRS-2 mRNA表达情况,阐明消膏转浊方的作用机制,为中医药治疗本病提供理论依据。 方法:实验分两部分进行: 第一部分:消膏转浊方的疗效}生研究(实验Ⅰ)Wister雄性SPF级大鼠40只,体重180—220克。适应性喂养1周后。随机分为5组。正常组(n=8)、模型组(n=8)、消膏转浊组(n=8)和罗格列酮对照组(n=8),以及饮食控制组(n=8)。同时自实验开始起,正常组以标准饲料喂养;其余组的大鼠每天饲以高脂饲料(即标准饲料的基础上加14%猪油、1%胆固醇),其蛋白质、脂肪、碳水化合物提供能量分别为18%、45%、37%。每天测定大鼠的摄食量,每周测定大鼠体重。 造模8周后,正常组饮食同前;模型组继续高脂喂养;消膏转浊治疗组以及罗格列酮组改为普通饲料喂养,同时给予药物治疗。消膏转浊方剂量为成人剂量10倍量(浓度为1.8生药/ml,灌胃勤6.44ml/kg);罗格列酮3mg/kg·d(浓度0.75mg/ml,灌胃勤4ml/kg灌胃治疗4周;饮食控制组改为普通饲料喂养,不用药物治疗,共为4周。给药4周后(即实验12周),大鼠清醒状态下固定于鼠板上,进行颈静脉抽血2ml,3000rpm离心10min,取血清-20℃储存,统一进行相关指标检测。大鼠恢复2天后,进行正常血糖-高胰岛素钳夹实验(简称钳夹实验),钳夹实验结束后,从颈动脉取血,按常规制备血清,-20℃中冻存待相关检测指标分析用。颈动脉采血后处死动物,迅速取出肝脏,用滤纸吸干液体并称重,并立即从肝脏的同一部位切取1块肝组织,取一小块切成约1cm<'3>大小,用10%磷酸缓冲甲醛液固定,送电镜观察,余下部分切成1.0cm×1.0cm×1.0cm在10%石中性甲醛固定后制备石蜡切片。HE染色,光学显微镜下观察,评估脂肪变性和炎症活动程度。肝脏其余部分根据测定指标的要求,用锡箔纸分块包裹,液氮保存。同时切取肠周围、双肾及附睾脂肪垫并称重。于模型建立及给药期间观察记录动物体重、食欲、行为、状态、毛发及死亡情况。计算肝指数。用全自动生化分析仪检测血清中的ALT、AST、CHO、TG、HDL-C、LDL-C,用普通分光光度计检测FFA。 第二部分:消膏转浊方的机制研究(实验Ⅱ-Ⅳ)动物造模、分组、用药情况同实验Ⅰ。钳夹实验结束后,取材同上。用快速葡萄糖分析仪检测空腹及稳态血糖;用放免法检测胰岛素:用半自动分光光度计检测肝匀浆MDA、SOD;用双抗体夹心ABC-ELISA法检测肝匀浆中的TNF-α和Leptin;用免疫组化法检测CYP2E1的蛋白表达;用实时荧光定量。PCR检测CYP2E1、InsR及IRS-2mRNA的表达。 结果: 第一部分:消膏转浊方的疗效学研究(实验Ⅰ)根据模型组大鼠肝组织病理及肝功能状态,成功复制大鼠NASH动物模型。与空白模型组相比,消膏转浊组大鼠体重明显降低(P<0.01);肝指数明显降低(P<0.01),腹脂明显减少(P<0.01);肝脏病理显示:消膏转浊组大鼠肝细胞脂肪沉积,炎症活动程度皆明显改善(P<0.01);消膏转浊方可以降低血清ALT、AST(P<0.05),CHO、TG及LDL-C(P<0.01);并可以显著地降低大鼠肝组织匀浆中的FFA的含量(P<0.01)。疗效优于单纯饮食组。 第二部分:消膏转浊方的机制学研究(实验Ⅱ—Ⅳ) ⒈消膏转浊法对非酒精性脂肪肝大鼠肝组织肿瘤坏死因子α及瘦素影响的实验研究:与模型组相比,消膏转浊方能够显著地降低肝组织中的TNF-α(P<0.01),降低肝组织中的瘦素(P<0.05); ⒉消膏转浊法对非酒精性脂肪肝大鼠脂质过氧化反应影响的实验研究:消膏转浊方可以显著降低大鼠肝组织匀浆中的MDA含量,提高SOD的活性(P<0.01)。免疫组化结果显示:消膏转浊组肝细胞内CYP2E1的表达局限在腺泡Ⅲ区中央静脉边缘周围的肝细胞内。定量分析结果显示:与模型组相比,消膏转浊组肝细胞中CYP2E1染色阳性的细胞面积和MOD值显著低于模型组(P<0.01);优于单纯饮食组。实时荧光定量结果:与模型组相比,消膏转浊组肝细胞中CYP2ElmRNA显著低于模型组(P<0.01)。⒊消膏转浊法对非酒精性脂肪肝大鼠胰岛素抵抗影响的实验研究:钳夹实验结果显示:与漠型组相比,消膏转浊方能够显著提高肥胖型非酒精性脂肪大鼠的葡萄糖输注率(P<0.01);空腹胰岛素比够结果:与模型组相比,消膏转浊组血清空腹胰岛素含量显著降低(P<0.01);实时荧光量结果显示:消膏转浊组InsR mRNA与IRS-2 mRNA的表达均显著高于模型组(P<0.01)。 结论: 1 消膏转浊方能明显降低NAFL大鼠体重、肝指数,并且可以显著减少大鼠肠周围脂肪组织重量。显示消膏转浊方对大鼠内脏肥胖有一定减肥作用,减轻内脏肥胖可能是消膏转浊方治疗大鼠非酒精性脂肪肝病变的作用机制之一。 2 消膏转浊方可以降低肝细胞内脂肪的沉积,从而减轻脂肪对肝细胞造成的水肿、缺氧以及炎症等损害,具有逆转肝脏脂肪沉积的功能。 3 消膏转浊方可改善非酒精性脂肪肝大鼠肝功能,具有一定的保肝作用,并且可显著降低肥胖型非酒精性脂肪肝大鼠的血脂及肝匀浆中的FFA,具有保肝降酶改善脂代谢的作用。 4 消膏转浊方可能够通过降低肝组织中INF-α的含量,间接减轻脂肪质过氧化反应,从而减轻肝细胞的炎症反应;降低瘦索的含量,改善瘦素抵抗,减轻胰岛素抵抗。 5 消膏转浊方可以显著地降低大鼠肝组织匀浆中的MDA,提高SOD的活性,抑制肝细胞内CYP2E1的蛋白及基因的表达;提示:消膏转浊方抑制肝CYF2E1的表达,提高肝组织抗氧化能力,缓解氧化应激,减少脂质过氧化反应的发生是其治疗脂肪肝的机制之一。 6 消膏转浊方可以提高葡萄糖输注率,降低血清中的胰岛素含量,改善胰岛素抵抗的状态。在胰岛素信号传导通路上,消膏转浊方通过增强肝细胞胰岛素受体和胰岛素受体底物2基因的表达,作用于受体及受体后两方面,改善胰岛素抵抗。
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