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缺氧/氧再灌注诱导心肌细胞衰老的机制及其干预研究
中文名称: 缺氧/氧再灌注诱导心肌细胞衰老的机制及其干预研究
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论文编号: 3101207收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: 无英文名称
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 内科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 心肌细胞 缺氧/氧再灌注 衰老 细胞周期 β-半乳糖苷酶活性 cyclin D1 CDK4 p16IN4Ka p21WAF1 p53 pravastatin 半乳糖苷酶活性
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论文简介:衰老是细胞脱离细胞周期并不可逆地丧失增殖能力后进入一种相对稳定的状态。自Hayflick等首次从人类纤维原细胞发现衰老现象后,人们逐渐发现人类其它各类细胞和其它物种的纤维细胞也存在着衰老。细胞发生衰老以后主要表现在细胞周期的改变、13.半乳糖苷酶活性的变化、线立体的皱缩与衰老基因的表达增加等。细胞衰老可以促进生物衰老,不仅与肿瘤发生有关,而且与心力衰竭、动脉粥样硬化、心律失常等心血管疾病发生有着密切的关系。因此,深入研究衰老的机制有着重要意义。 缺氧-氧再灌注是细胞、组织与器官最常见的损伤因素,也是诱导细胞发生衰老的常见方法。最近国外有研究显示缺氧与氧再灌可以使骨髓造血细胞发生衰老。 他汀类药物通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶的活性而抑制胆固醇的合成,常用来治疗高胆固醇血症,他汀类药物还可降低冠心病患者的死亡率、提高心脏移植患者的生存率、改善心肌重构等作用。除了调节胆固醇代谢外,最近Assmus等报道他汀类药物可通过上调细胞周期蛋白,下调细胞周期抑制因子p27K<'kipl>,抑制内皮祖细胞的衰老。Pravastatin除了心血管保护作用给患者带来的益处外,是否同时具有抑制缺氧/氧再灌注诱导心肌细胞衰老,对心脏产生保护作用呢? 在本研究中,将了解缺氧/氧再灌注是否能诱导培养SD乳大鼠心肌细胞发生衰老;研究缺氧/氧再灌注诱导培养SD乳大鼠心肌细胞发生衰老的机制;并拟采用pravastatin对缺氧/氧再灌注诱导SD乳大鼠心肌细胞的衰老进行干预,观察细胞周期与β-半乳糖苷酶活性等经典的细胞衰老指标的变化,以探讨pravastatin是否对心肌细胞衰老有抑制作用及可能机制。 第一部分 SD乳大鼠心肌细胞的培养、鉴定与缺氧/氧再灌注诱导建立SD乳大鼠心肌细胞衰老模型 目的:在成功分离、培养SD乳大鼠心肌细胞的基础上,探讨获得较纯心肌细胞的方法以及采用缺氧/氧再灌注诱导建立SD乳大鼠心肌细胞衰老模型的可行性。 方法:采用胰蛋白酶消化心肌组织分离单个心肌细胞,联合差速贴壁与培养基中加入Brdu杀死心肌成纤维细胞。心肌细胞在含1%O<.2>与99%N2的孵育箱中缺氧培养6 h,在21%02与5%CO<,2>孵育箱中进行氧再灌注培养24和48 h,建立心肌细胞衰老模型。采用免疫组化检测培养细胞α-actin表达情况;透射电镜观察心肌细胞超微结构改变:BrdU掺入试验了解心肌细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞周期;β-半乳糖苷酶试剂盒检测β-半乳糖苷酶活性。 结果:经α-actin抗体鉴定显示分离培养的细胞中95%以上是心肌细胞。心肌细胞经缺氧/氧再灌注诱导后,细胞体积变大、线立体明显皱缩。 细胞增殖结果显示缺氧/氧再灌注组心肌细胞Brdu阳性率较对照组有显著下降(P<0.01);细胞周期检测结果显示缺氧/氧再灌注组心肌细胞G0/G1期细胞较对照组有显著增多(P<0.01),S期细胞较对照组有显著减少(P<0.01);α-半乳糖苷酶活性检测结果显示氧再灌注组心肌细胞β-半乳糖苷酶活性较对照组与缺氧6 h有显著提高(P<0.01)。 结论: 1.采用胰蛋白酶消化心肌组织分离心肌细胞,联合差速贴壁与培养基中加入Brdu杀死心肌成纤维细胞,可以获得较纯的心肌细胞,经α-actin抗体鉴定显示分离培养的细胞中95%以上是心肌细胞。 2.我们首次采用缺氧/氧再灌注,成功诱导建立了SD乳大鼠心肌细胞衰老模型,为心肌细胞衰老机制的研究提供了稳定可靠的模型。 第二部分 缺氧/氧再灌注诱导 SD 乳大鼠心肌细胞衰老的机制研究 目的:从细胞周期调控方面探讨缺氧/氧再灌注诱导 SD 乳大鼠心肌细胞衰老的分子机制 方法:采用teal-time quantitative PCR与western blot方法检测培养SD乳大鼠心肌细胞在对照组、缺氧6 h、氧再灌注24和48 h,心肌细胞周期相关蛋白(D1),细胞周期依赖激酶(CDK4),细胞周期蛋白和细胞周期依赖激酶复合物抑制剂(p21WAF1,p16IN4Ka),Rb蛋白,p53等基因的mRNA与蛋白水平的表达变化。 结果: ⒈Cyclin D1与β-actin基因mRNA水平的比值在缺氧6 h、氧再灌注24和48 h分别为O.024,O.082,0.092,与对照组0.005相比有显著增高(P<'-7>-10<'-5>mol/1,方法参考第一部分方法。 结果:Pravastatin干预后对照组、缺氧6 h、氧再灌注24和48 h的G0/G1期细胞分别为71.98%,86.47%,84.98%,88.78%较实验组72.71%,87.45%,87.97%,89.78%没有明显减少(P>O.05),同样对照组、缺氧6 h、氧再灌注24和48 h的S期细胞分别为20.34%,9.02%,6.06%,5.79%较实验组20.03%,9.01%,5.06%,4.93%没有明显增多(P>O.05). Pravastatin干预后,对照组、缺氧6 h、氧再灌注24和48 h的半乳糖苷酶活性阳性细胞分别为9.13%,12.55%,42.15%,53.48%较实验组8.56%,12.37%,42.34%,58.28%没有明显减少(P>O.05),不同浓度pravastatin的干预,结果相似。 结论:Pravastatin不能抑制缺氧/氧再灌注诱导SD乳大鼠心肌细胞衰老。
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