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RNA干涉抑制hTERT对人脑胶质瘤细胞生长影响及机制研究
中文名称: RNA干涉抑制hTERT对人脑胶质瘤细胞生长影响及机制研究
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论文编号: 3101201收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Study on the Effect of Knock-down hTERT by RNAi on Glioma Cell
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 外科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: hTERT RNA干涉 DNA表达载体 慢病毒属 基因治疗 人脑胶质瘤 细胞生长
简介目录: 点击此处 免费索取本论文简介和目录>>
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论文简介:本文分为三部分: 第一部分:靶向hTERT小片段干涉RNA表达载体的构建和表达 目的:构建靶向hTERT的小片段RNA(siRNA)表达载体,为研究RNA干涉(RNAi)在哺乳动物细胞内抑制靶基因表达奠定基础。 方法:根据siRNA靶点设计的原则运用相关软件设计靶序列并合成其表达框,连接入质粒载体pRNAT-H1.1/Neo,转染293T细胞,荧光定量RT-PCR和western blot法检测转染后293T细胞中hTERT表达。 结果:重组质粒经测序鉴定证明hTERT siRNA转录模板完整、正确插入到pRNAT-H1.1/Neo质粒中,并筛选出一个抑制hTERT表达效率最高的序列,其hTERT表达仅达22.90%。 结论:成功构建并筛选出一个抑制效率最好的靶向hTERT的siRNA表达载体,为以hTERT为靶点的肿瘤基因治疗的后续研究奠定基础。 第二部分:靶向hTERT siRaNA慢病毒表达载体的构建 目的:通过构建靶向人端粒酶催化亚基(hTERT)RNAi慢病毒载体,获得可供转染的滴度,为下一步研究该基因缺陷在真核细胞中的影响提供物质基础。 方法:根据:hTERT设计的两条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链插入到pLVTHM质粒,生成含RNAi盒的载体,然后与pCMV-dR8.74和pMD2G病毒包装所必须的元件经脂质体导入T293细胞,包装成慢病毒,收集上清浓缩病毒并检测其滴度。RT-PCR检测干扰后细胞内hTERT表达变化。 结果:将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功;成功包装成高滴度的慢病毒。RT-PCR和TRAP检测结果证实构建的hTERT-siRNA慢病毒表达载体可显著抑制hTERT基因的表达和端粒酶活性。 结论:成功构建了携带靶向hTERT基因的RNAi慢病毒载体。该载体能够有效抑制hTERT的表达和端粒酶活性,为以hTERT为靶点的胶质瘤基因治疗的后续研究奠定基础。 第三部分:慢病毒介导的RNAi技术抑制hTERT表达对U87胶质瘤细胞的作用研究 目的:观测利用RNAi技术下调hTERT表达对U87人脑胶质瘤细胞的影响。 方法:将慢病毒为载体的靶向hTERT siRNA构建体-Lt-I感染u87细胞,含无效序列的慢病毒Lt-non作为空载对照,正常培养U87细胞作为阴性对照。RT-PCR检测hTERT表达,TRAP法检测端粒酶表达,MTT和流式细胞检测分析细胞增殖和周期变化,荧光原位杂交检测端粒长度变化,Transwell法分析细胞侵袭力,观测裸鼠皮下瘤生长。 结果:Lt-I可以明显下调hTERT的表达、端粒酶活性、细胞侵袭力和裸鼠皮下瘤生长。 结论:靶向hTERT的RNAi基因治疗能够抑制hTERT表达、端粒酶活性和细胞侵袭力,这些效应先于肿瘤细胞的端粒长度明显缩短前出现,表明hTERT在胶质瘤发生发展中发挥重要作用,可作为胶质瘤基因治疗的优选靶基因。
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