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加味桃核承气汤不同配伍组方及提取方法对糖尿病血管平滑肌细胞增殖、凋亡的影响
中文名称: 加味桃核承气汤不同配伍组方及提取方法对糖尿病血管平滑肌细胞增殖、凋亡的影响
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论文编号: 3101120收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Effects on of Modified Taohe Chengqi Decoction and Its Composition and Different Extractions on Cell Proliferation and Apoptosis of Diabetic Vascular Smooth Muscle Cell
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 中医临床基础
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 糖尿病 血管平滑肌细胞 桃核承气汤 细胞增殖 细胞凋亡 配伍组方 中药复方
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论文简介:本研究回顾了近20年来伤寒方及《伤寒论》名方“桃核承气汤”在DM 及其并发症防治方面的临床及实验研究成果;综述了中、西医抗糖尿病ACVD的临床及实验研究;阐明了糖尿病ACVD 与糖尿病血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cell,VSMC)增殖、凋亡的相关性;总结了中、西医对糖尿病VSMC增殖、凋亡的研究成果;探讨了体外培养细胞中药血清药理学研究的若干问题。同时,立足于加味桃核承气汤治疗DM及其ACVD并发症的实验及临床研究成果,以中药复方含药血清研究及细胞培养方法,运用四甲基偶氮唑盐比色法 (methy thiazolyltetrazolium,MIT)及流式细胞仪 (flow cytometer,FCM)、透射电镜等技术,观察加味桃核承气汤不同配伍组方及提取方法对糖尿病血管平滑肌细胞增殖、凋亡的影响。 1 理论与文献研究 疗效确切、配伍合理、药物精少的《伤寒论》经方,是进行中药复方实验研究的首选对象,其成果可作为研究其他方剂的基础。经方防治 DM 并发症的临床和实验研究有限,但填补了经方治疗 DM 并发症基础研究的部分空白,证实了部分伤寒方对于防治DM及其并发症确有成效,揭示了临床上治疗 DM 并发症常用经方部分作用机制,并且初步明确部分经方防治DM并发症的有效组分(不同的中药治法配伍组)。研究经方防治DM并发症,是中药复方研究本病的突破口之一,重视拆方研究、重视药动学、方与证相结合可能是今后的研究思路。 《伤寒论》名方“桃核承气汤”在DM及其并发症的防治方面,临床及实验研究己取得不少成果,总结了临床疗效,揭示了部分作用机制,初步明确了其防治DM及其并发症的部分有效组分。 多种因素如遗传、内皮细胞功能障碍、脂质代谢异常及VSMC功能异常、免疫复合物的形成、血栓形成等,在糖尿病ACVD发生中起重要作用。糖尿病,尤其是2型,其长期慢性的血管内皮低度炎症,可促进VSMC增殖,抑制其凋亡,而导致大血管并发症如动脉粥样硬化,因此,糖尿病ACVD与糖尿病VSMC增殖、凋亡密切相关。中医研究则发现,确诊的心血管疾病合并DM患者,其60-90%患者有血瘀证候。西药噻唑烷二酮类化合物(Thiazoliddinediones,TZDs)、胰岛素 (regularinsulin,RI)、二甲双胍不仅可以降低血糖,还可以发挥抗炎及抗动脉粥样硬化的作用;而治疗心血管疾病的常用药物他汀类调脂药、血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting-enyme inhibitor,ACEI)、血管紧张素受体阻滞剂(angiotensin receptor blockers,ARBs)、阿司匹林,通过发挥抗炎作用也可以改善2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM),为糖尿病ACVD的治疗提供了广阔的前景。干细胞移植术在糖尿病及其ACVD并发症的治疗也在探索中。中医或辨证论治,或专病专方,或分病辨证,明显改善了患者的血液流变学异常程度及临床症状。部分中药可防治糖尿病ACVD,而影响糖尿病VSMC增殖、凋亡,可能是其抗动脉硬化的作用机制之一。 2 实验研究: 2.1 目的: 观察加味桃核承气汤不同配伍组方及提取方法对DM血管平滑肌细胞 (vascularsmooth muscle cell,VSMC)增殖、凋亡的影响,以期优化配伍组方、初步筛选抗DM心血管病变有效成份,阐明《伤寒论》经典方剂桃核承气汤防治糖尿病ACVD的理论与临床的实验依据。 2.2 方法: 本研究依托广东省自然科学基金项目“加味桃核承气汤组方配伍及成分抗糖尿病血管病变的研究”(编号:31477)前期研究成果,采用中国基础医学细胞中心兔主动脉平滑肌细胞株,培养、冻存与传代,使用第16代细胞传代至第21代用于实验,以西药罗格列酮、美迪康作为对照,观察加味桃核承气汤不同配伍组方及提取方法对糖尿病VSMC增殖、凋亡的影响。实验分为三个阶段:第一阶段培养实验用 VSMC;第二阶段采用SD单性别(雄性)大鼠作为研究对象,制备大鼠空白血清及含药血清;第三阶段进行糖尿病VSMC损伤造模;第四阶段以MTT法、流式细胞仪及透射电镜观察加味桃核承气汤不同配伍组方及提取方法对VSMC增殖、凋亡的影响,比较各组作用差异。 2.3 结果: 本研究成功培养、冻存与传代家兔主动脉VSMC;采用SD 单性别(雄性)大鼠作为研究对象,以大鼠空白血清对VSMC的毒性确定稀释度为5,即含药血清的添加比例为20%;不同剂量组含药血清对VSMC的影响研究结果确定中剂量组较为适宜; 结合体表面积法,计算大鼠的药物灌胃量为等效剂量;腹主动脉采血分离血清,预实验及正式实验大鼠含药血清均一次性成功制备;研究不同浓度RI对VSMC增殖的影响证实,高RI 浓度可以促进VSMC 的增殖,发现3000mu/L RI组无明显诱导VSMC增殖作用,30mu/L及 300mu/L RI 组均有诱导VSMC增殖作用,但300mu/L RI 组增殖率更高,确定添加RI终浓度为300mu/L。以MTT法、流式细胞仪、透射电镜观察加味桃核承气汤不同配伍组方及提取方法对 VSMC增殖、凋亡的影响显示,MTT、法发现,空白组及活血+泻热通下组加药前后无显著性差异。加药后各组间比较显示,模型组较空白组增殖作用显著(P<0.01),表明RI诱导SMC增殖是成功的。不同配伍方面,罗格列酮组、加味桃核承气汤全方组、活血组、活血+泻热通下组均具有胰岛素诱导的VSMC增殖抑制作用。其中,活血+泻热通下组抑制率最高。不同提取方法方面,水提醇沉组,乙酸乙酯组及正丁醇组均具有显著的糖尿病VSMC增殖抑制作用,而以正丁醇组的增殖抑制率最高。 FCM 结果表明:胰岛素能促进 VSMC 增殖并抑制其凋亡,但与空白血清比较,其G0/G1期、S期、G2M期DNA含量均无显著性差异,机理有待进一步研究。 同模型组相比,罗格列酮组及中药各组促进凋亡作用均显著(P<0.01),但同加味桃核承气汤全方组相比,罗格列酮组、活血组、活血+泻热通下组、乙酸乙酯组促进凋亡作用更为显著(P<0.01)。促进糖尿病VSMC凋亡的药物有效成分,更大的可能存在于这4组当中。在促进糖尿病VSCM凋亡的机制方面,罗格列酮组可能与G0/G1、G2M 期阻滞有关;活血+泻热通下组活血组可能与 G2M 期阻滞有关;乙酸乙酯组可能与G0/G1、G2M 期阻滞有关。 电镜观察发现,正常培养的VSMC细胞,染色质分布均匀,细胞质富含线粒体、内质网、溶酶体,细胞膜完整,微绒毛丰富,也可见细胞核核膜消失,核中染色质密集,电子密度增高,成小斑块状,为处于分裂、增殖的细胞。凋亡细胞电镜下可见染色质浓缩成半月形,胞膜空泡化,细胞固缩,染色质边集,可见凋亡小体。结果显示,空白对照组、模型组、美迪康组、益气养阴组未见明显凋亡小体;罗格列酮组、加味桃核承气汤组、活血组、泻热通下组、活血+泻热通下组、水提醇沉组、乙酸乙酯组及正丁醇组可见程度不等的细胞凋亡,部分可见明显的凋亡小体。线粒体变化方面,空白对照组、美迪康组、益气养阴组线粒体数量正常,形态及嵴结构大致正常;模型组线粒体增多,嵴结构清晰;罗格列酮组、加味桃核承气汤组、活血组、泻热通下组、活血+泻热通下组、水提醇沉组、乙酸乙酯组及正丁醇组线粒体数量减少、嵴结构模糊。其抗糖尿病ACVD的主要成份,可能存在于除益气养阴组外的各配伍组当中及水提醇沉组、乙酸乙酯组、正丁醇组各组提取组中,罗格列酮组亦有相似的改变。从促进VSMC凋亡程度来看,罗格列酮组、活血组、活血+泻热通下组、乙酸乙酯组及正丁醇组更加显著。 2.4 结论: 加味桃核承气汤对糖尿病VSMC的增殖抑制及促进凋亡可能是发挥其抗糖尿病ACVD作用的途径之一;其抗糖尿病ACVD的主要成份可能存在于活血组及活血+泻热通下组中;乙酸乙酯组、正丁醇组中可能含有较多的抗糖尿病AVCD的有效成份。罗格列酮组亦有这方面的作用。在抑制糖尿病VSCM增殖并促进其凋亡的机制方面,罗格列酮组可能与G0/G1、G2M期阻滞有关;活血+泻热通下组、活血组可能与G2M期阻滞有关;乙酸乙酯组可能与G0/G1、G2M期阻滞有关:正丁醇组可能与S期、G2M期阻滞有关。 3 创新点: 3.1 对伤寒学发展的有益探索和创新本研究坚持中医药理论为指导,方证结合,方病结合,整体地研究《伤寒论》经方,从血管平滑肌细胞增殖与凋亡一动脉粥样硬化一糖尿病动脉硬化性心血管疾病的密切关联出发,应用拆方理论及不同提取方法研究经方复方,是对伤寒学科学术发展的有益探索和创新,为经方的现代化应用和研究提供了新的思路。 3.2 初步阐明加昧桃核承气汤不同配伍组方及提取方法影响糖尿病VSMC增殖及凋亡的作用途径及物质基础通过对不同配伍组方及提取方法血清药理学比较研究,初步阐明加味桃核承气汤治疗糖尿病VSMC增殖及凋亡的作用途径,为进一步鉴定、分离其主要作用成分提供了科学依据,为分析该方作用成分群进行尝试和创新。 3.3 探索中药复方防治糖尿病ACVD机制借助细胞生物学技术,对加味桃核承气汤不同配伍组方及提取方法防治糖尿病ACVD机制进行研究,推测影响糖尿病VSMC增殖和凋亡是其可能的机制之一。
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