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蛋白质组学技术筛选新生隐球菌侵袭血管内皮细胞相关蛋白质及其表达研究
中文名称: 蛋白质组学技术筛选新生隐球菌侵袭血管内皮细胞相关蛋白质及其表达研究
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论文编号: 3101056收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: The Study of the Protein of HUVEC Coculturing with Cryptococcus Neoformans by Proteome Screening
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 皮肤病与性病学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 新生隐球菌 血管内皮细胞 蛋白组学 二维电泳 蛋白质谱 蛋白质 人脐静脉血管内皮细胞
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论文简介:本课题拟以新生隐球菌侵袭血管内皮细胞模型为研究对象,采用二维凝胶电泳及生物质谱技术,分析研究血管内皮细胞蛋白质改变谱,选出在这一过程中可能起重要作用的部分蛋白质,同时利用荧光定量PCR技术分析这些蛋白质的mRNA在侵袭过程中不同阶段的转录情况,寻找在这一过程中起关键作用的蛋白质分子。 研究内容和方法: 建立新生隐球菌侵袭血管内皮细胞模型并筛选相应菌株:选取原代培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),培养扩增至所需数量。选取新生隐球菌标准野生株B3501、荚膜缺陷株Cap60和白化株Mel-这3种新生隐球菌,活化培养后制成菌悬液,加入血管内皮细胞培养基中,分别共孵育30min,1h,2h,3h,4h,5h。通过CCK-8法及流式细胞仪对血管内皮细胞孵育不同时段活性的检测,探索出新生隐球菌与血管内皮细胞孵育的适合时间,并确定以新生隐球菌标准野生株B3501作为下一步实验中所采用的菌株。 筛选与新生隐球菌孵育后血管内皮细胞的差异蛋白表达谱:利用2-D凝胶电泳技术对正常HUVEC细胞和与新生隐球菌B350l共孵育4小时后的HUVEC总蛋白进行电泳分离,获得相应蛋白质谱。ImageMaster Platinum5.0图形分析软件对凝胶图谱进行分析,筛选出正常细胞与孵育后细胞间的差异蛋白质点。选取部分差异表达蛋白点,利用MALDI-TOF MS对蛋白点进行肽指纹谱(PMF)鉴定。 部分蛋白在新生隐球菌侵袭血管内皮细胞不同阶段的表达变化情况:从正常细胞与癌变细胞差异表达蛋白谱中选取s100A10、Prx Ⅰ作为代表,利用荧光定量PCR技术观察这两种蛋白在正常细胞和与新生隐球菌共孵育1、2、4小时后的HUVEC中mRNA拷贝数的变化情况,对这2种蛋白在新生隐球菌侵袭血管内皮细胞中的作用进行推测和讨论。 实验结果: 不同新生隐球菌菌株对HUVEC的抑制率有着不同程度的影响,这可能与不同菌株的毒力因子发挥作用的机制不同有关。三种菌株在共孵时间为30min时,三者对HUVEC的抑制率相差不大,分别为40%,41%和40%,统计学上无明显差异。荚膜缺陷株Cap60对HUVEC的抑制率在1h达到最高峰79%:白化株Mel-对HUVEC的抑制率在3h到最高峰77%。荚膜缺陷株Cap60对HUVEC的抑制率最高,可以达到79%,且达到最高点所需时间最短,在1h达到最高点;白化株Mel-达到最高峰需要的时间略长,在3h时抑制率达到77%,远远高于野生株B3501。野生株B3501对HUVEC的抑制率随时间延长无明显变化,抑制率变化趋势比较平稳,孵育4小时后,HUVEC没有出现大量死亡。因此选取野生株B3501作为下一步实验的菌株,并以孵育4小时作为孵育条件。 双向凝胶电泳分析正常HUVEC细胞和与新生隐球菌B3501孵育4小时HUVEC细胞总蛋白,孵育组即实验组凝胶最后共得到921±33个蛋白点,正常细胞组即对照组最后共得到1025±38个蛋白点。3次电泳结果重复性良好,所有凝胶图谱的蛋白质点分布模式非常相似。实验组与对照组比较,共得到791个匹配蛋白点,实验组与对照组的点匹配率分别为77.17%和85.88%。 经过比对,实验组凝胶与对照组凝胶共找到可信差异表达蛋白点19个。其中有5个蛋白点仅在对照组细胞中表达,3个蛋白点仅在实验组细胞中表达,另有10个蛋白点在实验组细胞中表达降低,1个在实验组细胞中表达升高。 对所有仅在一组细胞中表达的的蛋白点和部分差异表达的蛋白点利用MALDI-TOF MS技术进行了PMF(肽指纹谱)鉴定,最后共有15个蛋白质点得到了鉴定。在得到鉴定的蛋白质点中,Prohibitin和Heat-shock protein beta-1仅在实验组中表达,peroxiredoxin 1等蛋白仅在对照组中表达,S100A10在实验组中表达增加,超氧化物歧化酶等蛋白在实验组中表达下降。有许多研究表明这些蛋白参与了细胞的代谢、增殖、信号转导、运动等生理功能。 荧光定量PCR检测发现: ⒈S100A10的mRNA拷贝数在正常细胞组、孵育1小时、2小时、4小时组中逐渐上升,除去正常细胞组和孵育1小时组之间无明显差异(P>0.05)外,其余各组之间存在统计学差异(P<0.01)。⒉Prx Ⅰ的mRNA拷贝数在正常细胞组、孵育1小时、2小时、4小时组中逐渐下降,下降速度快,各组之间均存在统计学差异(P<0.01)。孵育4小时组中Prx Ⅰ的转录几乎被完全抑制。 讨论: 新生隐球菌入侵人体是一个复杂的过程,血管内皮细胞构成的屏障是其入侵机体乃至中枢神经系统中最初的也是最关键的一道屏障。因此,了解新生隐球菌和血管内皮细胞的相互作用,对于揭开其感染机制可能具有重要的意义。由于蛋白质是基因的最终产物和最终执行者,一切疾病的发病都和蛋白质数量和功能的改变有关,因此从蛋白质层面研究两者的相互作用可能更为直接。二维凝胶电泳具有快速、并行、高通量的特点,具有高灵敏度和高分辨率,可以很好地与质谱分析相匹配,能够同时对全基因组水平的大量蛋白质进行筛选和研究。在本研究中,建立了新生隐球菌和人脐静脉血管内皮细胞相互作用的模型,利用二维凝胶电泳对新生隐球菌孵育后的HUVEC总蛋白质与正常HLNEC总蛋白质进行了分离鉴定,初步鉴定出13个差异表达的蛋白点。这些蛋白参与了细胞的代谢、增殖、信号转导、运动等生理功能,提示这些蛋白表达的改变可能是新生隐球菌影响HIJVEC功能的手段。 纵观以上蛋白,可以发现这些蛋白的功能主要集中在三个方面,一是调节细胞凋亡,二是参与细胞骨架,三是参与细胞代谢。蛋白S100A10(Calpactin Ⅰlight chain),依钙蛋白Ⅰ轻链,又称p11蛋白、S100A10蛋白,属于钙结合蛋白家族中的S100蛋白家族。S100蛋白家族分子量在10~12kD,其氨基酸序列高度保守,与其他钙离子结合蛋白具有高度同源性。S100蛋白的两个亚基与钙离子结合后,与靶蛋白结合从而发挥其生物学效应,其功能与细胞周期进程、细胞凋亡、细胞分化、细胞骨架、细胞迁移等有关,对肿瘤的发生发展有重要意义。S100A10蛋白的靶蛋白是S100蛋白家族的另一成员膜联蛋白Ⅱ(annexinⅡ、依钙蛋白Ⅰ重链),两者形成一紧密的四聚体膜联复合物,它们形成的复合物有信号转导的作用,可对肌动蛋白细胞骨架的活动产生明显的影响。而肌动蛋白细胞骨架支持着细胞的各项活动如胞吞、胞吐、定向生长、黏附、迁移等。有研究显示,annexin Ⅱ与巨噬细胞的吞噬功能及细胞分泌功能均有关系。敲除annexinⅡ的表达可减少神经胶质瘤细胞的迁移。这些都说明S100A10的表达增高,可能对细胞迁移及胞吐作用、内吞作用具有重要意义。本实验中,实验组细胞中S100A10蛋白表达增加,表明HUVEC细胞骨架活动可能增加,细胞的迁移、胞吞、胞吐等活动有可能增强。推测HUVEC出现上述现象对于新生隐球菌穿越血管屏障是有利的,也可能是新生隐球菌通过血管内皮细胞层的机制之一。推测新生隐球菌可能增强HUVEC胞吞、胞吐等活动,先被HUVEC吞噬,然后从内皮细胞的另一侧被释放,从而穿越了血管屏障。 Peroxiredoxin(Prx)是新发现的一类过氧化物酶,其催化活性和蛋白序列与其他抗氧化剂完全不同,广泛存在于原核生物和真核生物中。在哺乳动物中,Prx蛋白家族包括6个成员,Prx Ⅰ-Ⅵ,其生化功能是通过硫氧还蛋白利用谷胱甘肽作为还原剂,还原、消除代谢产生过氧化物或超氧化物。Prx Ⅰ定位于细胞质中,是一个可诱导的蛋白,在氧化应激条件下其表达显著增高。有实验证实,通过腺病毒介导转化增加peroxiredoxin基因的表达,可保护细胞膜免受磷脂过氧化物介导的膜损伤,使小鼠肺免于高氧损伤,并使小鼠在高氧条件下的生存时间延长。 以上这些蛋白与Prx Ⅰ、S100A10相互印证,进一步提示,新生隐球菌和HUVEC作用后可能通过以下几个方面影响HUVEC的正常生理功能: 一、减少HUVEC对氧应激的耐受能力,细胞损伤增加,增殖能力下降。 二、增强细胞骨架活动能力,促进细胞胞吞胞吐活动。S100A10与靶蛋白形成的复合物可能增强细胞骨架活动,加强胞吞胞吐活动,新生隐球菌可能通过先被吞噬,穿过细胞后被释放的方式穿越血管内皮细胞屏障。另外Prohibitin增高也可能促进了细胞骨架的活动。 三、促进细胞凋亡。HSP27和PSA7等可能与细胞凋亡过程有关,促进了HUVEC细胞凋亡。 四、影响了HUVEC正常的细胞内信号转导过程。Prx Ⅰ、S100A10和CacyBP等蛋白都参与了细胞内的信号转导过程,细胞的正常生理功能也受到了影响。 五、抑制细胞能量代谢。AK4、苹果酸脱氢酶的表达下降可能使细胞能量代谢受到抑制,细胞ATP水平下降,导致细胞生理活动减弱,细胞功能紊乱。 以上五个方面的作用,使得HUVEC凋亡增加,增殖减少,从而破坏了血管内皮细胞层的完整,进而破坏血管屏障功能的健全,为新生隐球菌穿越血管屏障创造良好的条件。同时发现,在细胞总体生理功能下降的同时,细胞的细胞骨架活动却得到了增强,因此推测新生隐球菌能促进HUVEC的细胞骨架功能,加强其吞噬和胞吐能力,可能对新生隐球菌穿越血管内皮细胞屏障是有利的。这也可能是导致新生隐球菌穿越气血、血脑屏障的机理之一。如能弄清这种机制产生的具体过程,抑制这一过程,可能对新生隐球菌病的预防具有一定的意
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