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柽柳、星星草金属硫蛋白基因克隆及生物学功能研究
中文名称: 柽柳、星星草金属硫蛋白基因克隆及生物学功能研究
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论文编号: 3100857收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Cloning and Biology Function Research of Metallothionein Genes from Tamarix Androssowii and Puccinellia Tenuiflora
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 林木遗传育种
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 柽柳 星星草 烟草 MT基因 金属硫蛋白 生物学功能 土壤重金属污染
简介目录: 点击此处 免费索取本论文简介和目录>>
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论文简介:我国土壤重金属污染问题不断恶化,亟待解决。深入研究植物的耐重金属机理,克隆相关基因并利用基因工程技术提高植物对重金属的抗性,是净化污染土壤的一条有效途径。金属硫蛋白(metallothioncin,MT)是一类广泛存在于生物中的低分子量,富含半胱氨酸可结合重金属的蛋白质,在土壤重金属污染的治理中越来越引起人们的重视。 应用生物信息学技术从柽柳和星星草cDNA文库中分别克隆了柽柳和星星草的 MT基因,对该基因编码的MT进行了蛋白质家族、疏水性、信号肽、等电点及分子量的预测,并选取了几种植物的 MT 基因氨基酸序列进行了多序列比对分析及分子进化树绘制,结果表明克隆的柽柳和星星草MT基因符合植物MT基因所具有的典型特征。 将从柽柳中克隆到的MT基因构建到载体pROKⅡ上,通过农杆菌介导的叶盘法对烟草进行遗传转化,共获得75株卡那霉素抗性苗,转化率达到78%。选取10株长势良好的转基因烟草进行分析,PCR检测结果均为阳性;对其中6个转基因株系进行PCR-Southern杂交和Northern杂交,结果均为阳性,证明外源基因已整合到烟草基因组中并得到表达。 将在柽柳和星星草中克隆到的MT基因分别连接到载体pROKⅡ上,构建了柽柳和星星草MT基因双价植物表达载体,对烟草进行遗传转化,共获得83株卡那霉素抗性苗,转化率达到75%。选取10株长势良好的转基因烟草进行分析,PCR检测结果均为阳性:对其中7个转基因株系分别用柽柳和星星草MT基因标记的探针进行PCR-Southern 杂交,结果均为阳性;再从中选取5个转基因株系进行Northern杂交,结果均为阳性,证明外源基因已整合到烟草基因组中并得到表达。 对非转基因对照烟草、转柽柳MT基因烟草和转柽柳、星星草MT基因烟草T<,0>代组培苗进行了重金属Cd和Cu胁迫试验,测定并分析了各转基因烟草及非转基因对照烟草胁迫后的生根率、增重和株高变化。结果显示,T<,0>代转基因烟草在不同浓度CdCl<,2>和CuSO<,4>胁迫条件下,生根率、增重和株高均高于非转基因对照烟草。在CdCl<,2>胁迫下,非转基因对照烟草能在100μmol·L<'-1>CdCl<,2>浓度下生长,转柽柳MT基因烟草能在200μmol·L<'-1>CdCl<,2>浓度下生长,而转柽柳、星星草MT基因烟草能在300μmol·L<'-1>CdCl<,2>浓度下生长。在CuSO<,4>胁迫下,在75 μmol·L<'-1>CuSO<,4>浓度下,三者均能正常生长;在150μmol·L<'-1>CuSO<,4>浓度下,对照烟草不能生长,转柽柳MT基因烟草生长缓慢,植株矮小,转柽柳、星星草MT基因烟草大部分能正常生长;在225μmol·L<'-1>CuSO<,4>浓度下,转柽柳、星星草MT基因烟草不能生长,但生长量有所增加。试验表明,MT基因的导入提高了T<,0>代转基因烟草对Cd和Cu的耐受力,其中转基因烟草对Cd的抗性要高于对Cu的抗性,并且转双价MT基因比转单价MT基因更能提高转基因烟草对重金属的耐受力。 将T<,0>代自交得到的转基因烟草种子播种于含100 mg/LKan的MS培养基上培养20 d后,对8个转基因株系的绿白苗之比进行统计,结果表明转柽柳MT基因烟草T<,1>-5、T<,1>-8和转柽柳、星星草MT基因烟草T<,1>′-2、T<,1>′-3的绿色苗与白化苗分离规律基本符合(2<'2>-1):1;转柽柳MT因烟草T<,1>-6和转柽柳、星星草MT基因烟草T<,1>′-9株系的绿色苗与白化苗分离规律基本符合(2<'4>-1):1。 对8个转基因株系卡那霉素抗性植株进行PCR检测,结果均为阳性,初步证明了MT基因仍整合在烟草子一代基因组中。 对8个转基因烟草株系子一代(T<,1>)进行了Cd胁迫试验,测定并分析了CdCl<,2>胁迫下转基因烟草生长量的变化。结果显示,转基因烟草T<,1>代组培苗在根长、根数、苗增重、叶片数方面均高于非转基因对照烟草。转柽柳MT基因烟草能够在CdCl<,2>浓度为100μmol-L<'-1>培养基上生长良好,平均增重是非转基因对照的3.07倍,平均根长是非转基因对照的1.96倍;转柽柳、星星草MT基因烟草能够在CdCl<,2>浓度为200μmol-L<'-1>培养基上生长,平均增重是非转基因对照的3.85倍,平均根长是非转基因对照的2.74倍;而非转基因对照烟草在CdCl<,2>浓度为100μmol-L<'-1>时就表现为生长缓慢,根系受到明显抑制。试验表明转双价MT基因烟草比转单价MT基因烟草具有更强的Cd抗性。证明了外源MT基因可以在烟草子一代中遗传,该基因的表达提高了烟草对Cd胁迫的耐受能力。
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