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羽衣甘蓝自交不亲和相关基因的分离及反应途径中蛋白质磷酸化和泛素化的动态变化
中文名称: 羽衣甘蓝自交不亲和相关基因的分离及反应途径中蛋白质磷酸化和泛素化的动态变化
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论文编号: 3100843收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Isolation of Genes and Dynamic Change of Phosphorylated and Ubiquitinated Protein Level in the Self-incompatibility Response of Brassica Oleracea var. Acephala
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 发育生物学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 羽衣甘蓝 SCR_(13b) BoARC1 蛋白质磷酸化 蛋白质泛素化 自交不亲和 自交不亲和系
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论文简介:花粉与柱头间的信号识别与传递,是植物进行受精作用的前提条件。植物自交不亲和性(Self- incompatibility,SI)是指雌蕊对自己和异己花粉进行识别,通过细胞内信号传递与级联反应,最终抑制自己花粉的生长,阻碍受精作用的过程。SI 是植物采取的一种促进异交、避免自交的策略。对植物SI信号转导的研究,不仅在植物生殖生物学上具有重要的意义,而且在育种上也具有实际的应用价值。本文以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)为实验材料,对SI进行了如下方面的研究: 1. 羽衣甘蓝S<,13b>单倍型纯合体的鉴定以羽衣甘蓝‘赤兔’和‘白波’两个品种为实验材料,利用亲和指数法经过3代的自交选育,获得了 9 号自交不亲和系和 14 号自交亲和系。利用 SRK 特异性引物 PK1 和PK4,采用 PCR 方法分别从花期柱头和叶片中分离出9号自交不亲和系SRK的cDNA和DNA序列。经过 Blastn 分析表明,获得的序列与甘蓝SRK<,13b>序列完全一致,因此认为9号自交不亲和系含有S<,13b>单倍型。通过对9号自交不亲和系、9号自交后代、9号×14号杂交F<,1>代及14号自交亲和系进行了SRK的PCR-RFLP和Southern杂交分析,鉴定出9号自交不亲和系是S<,13b>单倍型纯合体。 2.分离羽衣甘蓝S<,13b>S<,13b>自交不亲和系花粉中的SCR<,13b>利用SCR基因保守的信号肽编码区设计 SCR 特异性引物1和锚定 oligo(dT)<,18>引物,采用RF-PCR方法从羽衣甘蓝蕾期花药中分离SCR<,13b>的cDNA片段。经过Blastn分析表明,羽衣甘蓝SCR<,13b>与甘蓝SCR<,13>序列具有高度的同源性,差异仅在于3个核苷酸(AAG)的插入和3个核苷酸(TT和C)的缺失。然后,利用甘蓝SCR<,13>的5’非翻译区和3’非翻译区设计SCR<,13b>的特异性引物,获得了羽衣甘蓝SCR<,13b>编码区序列。SCR<,13b>编码78个氨基酸,其氨基酸序列与甘蓝SCR<,13>有98.3%的序列一致性。SCR<,13b>基因DNA序列中含有一个758 bp的内含子,内含子的5’供体位点和3’受体位点边界序列分别是5’-GU和3’-AG,符合内含子边界序列的GU-AG规则。 将分离的羽衣甘蓝SCR<,13b>成熟肽编码区插入到pGEX-KG、pET-32a 原核表达载体中,构建 pGEX-KG-SCR<,13b>和pET-32a-SCR<,13b>表达质粒,分别转化到 DH5α、BL21(DE3)pLysS表达菌株中,通过蛋白质的表达和纯化,获得GST-SCR<,13b>和His-SCR<,13b>融合蛋白。利用生物授粉分析的方法,将GST-SCR<,13b>及His-SCR<,13b>融合蛋白涂抹在羽衣甘蓝S<,13b>S<,13b>自交不亲和系柱头乳突细胞上,然后进行与14号自交亲和系的杂交授粉,结果发现S<,13b>S<,13b>柱头乳突细胞产生了SI反应,抑制了14号花粉的生长。这说明羽衣甘蓝SCR<,13b>是花粉中SI的信号分子,引起了SI反应从而干扰了杂交亲和授粉。 S<,13b>单倍型与S<,13b>单倍型具有相同的SI识别特异性,但SCR<,13b>与SCR<,13b>具有不同的核酸序列。本研究分离出的羽衣甘蓝SCR<,13b>,其氨基酸序列不同于甘蓝SCR<,13b>,但具有较高的一致性。羽衣甘蓝SCR<,13b>与其它的SCR氨基酸序列比对时发现,有7个半胱氨酸残基在SCR成熟肽内是保守的。通过系统进化树分析,SCR的聚类足根据SI强弱性质而划分的,而不是根据物种进行聚类的。 3.分离鉴定羽衣甘蓝SI信号传递因子BoARC1利用油菜BnARC1的序列设计引物,采用RT-PCR方法从花期柱头中分离出羽衣甘蓝BoARC1。它编码一个663个氨基酸,分了量约为73 kDa的蛋白质。在氨基酸序列比对中,BoARC1与BnARC1具有94%的一致性。Southern杂交显示,BoARC1在羽衣甘蓝S<,13b>S<,13b>自交不亲和系基因组中只存在单一拷贝。Northern杂交分析表明,BoARC1特异性的在植株开花或接近开花时期的柱头中表达。在酵母双杂交实验中,BoARC1能够通过C端的臂重复结构域分别与SRK<,3>、SRK<,13b>和SRK<,910>的胞内域相互作用。这些说明了BoARC1是SRK下游的一个保守信号成分,参与SI信号的传递。 BoARC1 含有 U-box 结构域和臂重复结构域的蛋白质,是植物中一类特有的蛋白质。在系统进化分析中,BoARC1 和 BnARC1 主要与拟南芥的 PUB17、烟草和马铃薯的 ACRE276 蛋白质、水稻 ACRE 蛋白质聚类在一起。而这些蛋白质主要在植物的疾病防御方面发挥关键作用。这暗示着 BoARC1 可能在植物其它信号转导方面也发挥着重要作用。 4.SI反应途径中蛋白质磷酸化、泛素化的动态变化利用磷酸化蛋白质探针和免疫印迹方法,检测羽衣甘蓝S<,13b>S<,13b>自交不亲和系自交授粉过程中柱头乳突细胞内蛋白质磷酸化的动态变化。发现自交授粉5 min的柱头乳突细胞膜蛋白质磷酸化水平出现高峰:自交授粉15 min的柱头乳突细胞质蛋白质磷酸化水平出现高峰,随后蛋白质磷酸化又逐渐地恢复到未授粉水平。而在S<,13b>S<,13b>×14号杂交亲和授粉过程中,蛋白质磷酸化的动态变化水平是比较稳定的。此外,利用抗泛素抗体和免疫印迹方法,检测羽衣甘蓝S<,13b>S<,13b>自交不亲和授粉过程中柱头乳突细胞内蛋白质泛素化水平变化。发现在自交授粉0.5 h蛋白质泛素化水平明显增高,直到1h蛋白质泛素化水平仍然维持着较高水平。而在S<,13b>S<,13b>×14号杂交亲和授粉过程中,柱头乳突细胞内蛋白质泛素化水平并没有出现增高的趋势。蛋白质磷酸化发生在SI信号转导的早期阶段,可能在调控柱头乳突细胞对细胞外的信号识别及细胞内的信号传递方面扮演着重要角色。而蛋白质泛素化水平的变化发生在SI信号转导的后期阶段,可能通过降解柱头乳突细胞内的蛋白质来参与SI反应。蛋白质磷酸化与泛素化的协同作用调控SI的信号转导,可能是植物信号转导中一种普遍地调控方式。对蛋白质磷酸化与泛素化在SI反应途径中柱头乳突细胞内动态变化的阐述,为认识SI发生的分子机制提供了重要的线索。
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