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新型微管结合蛋白NuSAP的有丝分裂期调控功能及DNA结合能力研究
中文名称: 新型微管结合蛋白NuSAP的有丝分裂期调控功能及DNA结合能力研究
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论文编号: 3047577收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: 无英文名称
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 细胞生物学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 结合蛋白 DNA NuSAP 有丝分裂期阻滞 p53 ATM 微管结合活性 微管结合蛋白
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论文简介:有丝分裂期(mitosisphase)调控是细胞生物学领域的中心问题之一,纺锤体组装和染色体分离是其中心事件,它的正常进行依赖于微管的正确调控,但至今仍有大量谜题需要回答。NuSAP(nucleolarspindle-associatedprotein)是2003年新发现的一种新型微管结合蛋白,在间期细胞内定位于核仁,在分裂期细胞内与纺锤体共定位。它的表达在G2/M期到达峰值,有丝分裂后逐渐消失。提示它的表达定位都呈强烈的周期性。作为一种微管结合蛋白,它参与纺锤体的组装,它的低表达对纺锤体的正常组装产生严重的影响。这表明NuSAP是一种重要的微管调控分子,因而可能参与有丝分裂期调控。但是,NuSAP的研究仍有许多问题需要回答。例如NuSAP在哪些正常人组织/细胞中发挥作用?在无NuSAP内源性表达的细胞中,外源的NuSAP的表达会造成怎样的影响?NuSAP是否及如何参与有丝分裂期调控? 首先我们对NuSAP进行了基本的生物信息学分析和表达谱研究。不同物种间序列比对揭示NuSAP具有四个保守区域,对应于SAP结构域、核定位信号(nuclearlocalizationsignal,NLS)和微管结合功能域,提示这些保守区对于NuSAP的功能非常重要。组织表达谱分析表明NuSAP高表达于胎肝、胸腺、骨髓及多种血液来源的肿瘤细胞系中。而在高度分化的免疫器官/组织—淋巴结、脾脏和外周血中NuSAP丰度很低甚至没能检测到表达,提示NuSAP可能在造血/免疫组织中发挥作用。 其次,我们的研究表明NuSAP的表达将多种肿瘤细胞持续地阻滞在M期,至少从转染后16-72小时没有检测到检查点逃逸现象。提示NuSAP诱导的细胞周期阻滞并非短暂的过程,很可能是一种不可逆的阻滞。通过构建截短体,揭示该蛋白微管结合结构域对于周期阻滞功能是必需的,提示NuSAP结合微管的活性是诱导细胞M期阻滞的基础。 由于p53是M期检查点的重要调控分子,负责阻止细胞从有丝分裂检查点逃逸,防止多倍体产生。于是我们分析了p53在NuSAP诱导的有丝分裂期阻滞中的角色。研究发现NuSAP导致p53野生型、突变型和敲除细胞均发生周期阻滞,而且NuSAP的表达对p53野生株HCT-116的内源性p53蛋白水平没有明显影响,表明NuSAP能以p53非依赖的方式诱导细胞M期阻滞。在研究中,我们意外地发现,在AT细胞中NuSAP表达时,从转染16小时至48小时都未能检测到明显的G2/M期阻滞。而AT细胞是ATM失活的细胞系;同时揭示ATM的抑制剂-咖啡因能明显地抑制NuSAP诱导的COS7细胞有丝分裂期阻滞,并且这种抑制呈浓度梯度依赖,提示ATM可能对NuSAP诱导M期阻滞是必需的。 以上结果,证明了NuSAP对于M期具有重要的调控作用。它诱导的周期阻滞可能依赖于其微管结合活性和ATM的正常功能,因此NuSAP是一种具有组织特异性的M期重要功能分子。
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