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人spindlin1基因的功能研究
中文名称: 人spindlin1基因的功能研究
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论文编号: 3047472收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Spindlin 1, a Novel Nuclear Protein with a Role in the Transformation of NIH3T3 Cells
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 病理学与病理生理学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 基因 spindlin1 亚细胞定位 成瘤性 信号传导 卵巢癌 基因表达
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论文简介:卵巢癌是目前严重威胁妇女健康的恶性肿瘤,由于缺少早期临床诊断症状,60-70%的卵巢癌处于晚期诊断,手术难以根治,而目前治疗卵巢癌的药物特异性和敏感性均较差,使得卵巢癌在妇科肿瘤中死亡率最高,5年生存率一直徘徊在40%左右。因此寻找在卵巢癌的发生中敏感和特异的基因改变将有可能为临床卵巢癌的诊治提供有意义的生物学指标,为抗癌药物的研究提供新靶点,具有重要的理论和实际意义。 我们研究小组采用改良的mRNA差异显示PCR技术对卵巢癌和正常卵巢组织之间的差异表达基因进行了一系列的筛选和鉴定,获得并克隆了一个新基因,由于它与鼠类spindlin基因高度同源,因此命名为人spindlin1基因(GenBank登录号为AF317228)。对其分析如下: 1新基因eDNA长度为4375bp,基因在236-949bp含有完整开放读框,预测编码由237个氨基酸组成的蛋白质。在新基因cDNA开放读框的第一个ATG上游-126bp处有同框终止密码子TGA,在3'末端4350bp处为典型的加尾信号AATAAA,此后18bp处为polyA尾。新基因cDNA全长序列与鼠的spindlin基因核酸序列具有96%同源性。基因在236-949bp含有完整开放读框,编码237个氨基酸,所编码氨基酸与鼠spindlin基因所编码的241个氨基酸具有98%的同源性。且新基因与鼠spindlin1基因一样、均在3'端具有长的非编码调控序列。即新基因cDNA在核酸序列、编码氨基酸序列和基因结构三方面与鼠的spindlin基因高度同源。Spindin1基因内含子和外显子剪切位点分析表明,所得基因序列与人第9号染色体RP11-317b17克隆序列中的5个部分顺序一致,可以推断基因来源于人第9号染色体。cDNA由5个外显子组成,基因组DNA由五个外显子和4个内含子组成,基因组全长为52.3kb。进一步分析基因组中内含子和外显子的结构特征,表明内含子和外显子之间的剪切完全符合GT-AT法则。 2spindlin1基因编码蛋白为一亲水性膜内蛋白,分子量约为27Kd,等电点为5.615。它含有三个重复的spin-ssty结构域,属于spin/ssty家族。生物信息学预测其具有MAPK磷酸化位点、酪氨酸蛋白激酶磷酸化位点、RNA结合蛋白作用位点、cAMP依赖性酪氨酸蛋白激酶磷酸化位点、PKC磷酸化位点等。 3spindlin1基因的染色体定位分析表明其定位在第9号染色体的长臂9q22.1-22.3区域,经查询,9号染色体长臂末端在肿瘤遗传学研究领域具有非常重要的意义。 4对人spindlin1基因在不同发育时期的胚胎组织(卵巢、胃、子宫、脾、胸腺、肾、。肾上腺、肝、脑、小肠)中的表达进行检测,结果表明:spindlin1表达于4月胎龄的卵巢、肾上腺组织,而在8月胎龄的胚胎组织中则无表达,由此提示该基因参与胚胎早期发育。 5细胞表达谱结果表明:spindlin1广泛表达于肝癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病等细胞,而在正常基质细胞、人肺成纤维细胞及肺癌细胞中不存在。另存在于造血干细胞、间充质干细胞等较为早期的干细胞中。 基于上述,我们推测人新基因spindlin1有可能是参与胚胎发育以及肿瘤发生发展的重要基因。为此,我们构建了spindlinl-EGFP-N1融合基因表达载体,通过脂质体转染,首先对其在cos-7细胞中的定位进行了研究。结果在转染后细胞中发现了融合蛋白的表达部位主要位于胞核中,并发现明显的双核和多核现象。提示作为一个在卵巢癌中高表达的基因,spindlin1在细胞核中的高表达可能参与了细胞恶性相关基因的转录。 同时我们将EGFP-Nl-spindlin1融合表达载体转染至NIH3T3细胞中,经G418抗性筛选3w,RT-PCR证实并得到了表达spindlin1的稳定细胞株。对其检测结果发现,其高表达可使促进NIH3T3细胞增殖,使其处于S期和G2/M期的细胞比例增加;将此细胞株接种于双层软琼脂上,14天后发现有克隆长出,经统计,其克隆形成率为5.4%±2.4,对照组3T3则无克隆形成。软琼脂中含有酸性粘多糖,对一般细胞的生长具有抑制作用,而对病毒转化和恶性转化的细胞则影响甚小。因此我们认为spindlin1可使3T3细胞发生恶性转化。为了作进一步的确证,我们将此表达spindlin1的稳定细胞株接种于裸鼠背部皮下,2-4周后即见瘤状物生成,并逐渐增大(致瘤率为38%),对照组则无肿瘤发生。HE染色可见胞核深染,大小不一,异行性较为明显。病理组织学分析表明瘤细胞分化程度低,具有明显的核异型性。提示生成瘤体为恶性肿瘤。经过westernblotting进一步分析,证实了生成的肿瘤中均有spindlin1的表达。由此我们得出结论:spindlinl可使3T3细胞发生恶性转化。 为进一步探讨3T3细胞发生恶性转化的具体机制,我们检测了spindlin1过表达后Ras/Raf/MEK/ERK和Akt/BAD两条通路中信号分子的变化。结果显示spindlin1可能作为DNA结合蛋白或通过激活其它中介的转录因子使得P44/42MAPK总的表达量增高,从而激活了Ras/Raf/MAPK信号通路,进一步通过其下游的响应信号引起细胞过增殖。另可通过GSK-3β磷酸化后导致其失活,一方面通过破坏细胞内β-Catenin的降解通路,引起下游基因转录的改变,从而导致增殖或抗凋亡通路的激活;另一方面可抑制APC复合物,通过增强细胞迁移性,引发细胞癌变。由于上述只检测了部分信号分子,因此对spindlin1引起3T3细胞发生恶性转化的机制仍有待于进一步研究完善。
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