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人胎肝细胞质膜和人红细胞膜蛋白质组分析
中文名称: 人胎肝细胞质膜和人红细胞膜蛋白质组分析
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论文编号: 3047361收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Proteomic Analysis of Plasma Membranes from Human Fetal Liver and Human Red Blood Cell
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 生物化学与分子生物学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 肝细胞 红细胞 膜蛋白 人胎肝 细胞质膜 红细胞膜 蛋白质组 蛋白复合体 蛋白定位 质谱
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论文简介:细胞质膜构成细胞对外界环境的屏障和细胞内外环境交流的界面,镶嵌或连接于其中的蛋白质对维持细胞正常的生理活动具有十分重要的作用,这些蛋白质参与细胞—细胞或细胞—细胞外基质的识别、粘附、连接和通讯,信号的接受和跨膜传导,细胞内外物质的转运等,影响着细胞的生长、发育、分化、病变等。细胞质膜蛋白占到已知药物靶标的70%,因此,细胞质膜已经成为广泛的药物设计的靶标,细胞质膜蛋白质组得到学术界的高度重视。 16-24周孕龄人胎肝处于关键的造血调控和发育分化时期,分析人胎肝细胞质膜蛋白质组有助于对人胎肝的这些生理活动的认识。我们用差速离心和密度梯度离心提取纯化了人胎肝细胞质膜,细胞质膜标志酶-5’单核苷酸酶特异酶活测定显示其富集度达到16倍。用SDS-PAGE-RPLC-ESI-MS/MS和“shotgun”(蛋白三重裂解-SCX-RPLC-ESI-Q-TOF-MS)两条技术路线,我们从人胎肝细胞膜和碱处理细胞膜中鉴定了总共532个非冗余蛋白质,另有82个蛋白group。这是目前已知最大的人类组织细胞质膜表达谱。在人胎肝细胞质膜蛋白质表达谱中,已知明确定位于细胞质膜上的蛋白质126个,占鉴定蛋白总数的24.5%。跨膜蛋白162个,占30.5%,未知蛋白41个。126个细胞质膜蛋白基本覆盖了细胞质膜上所有的功能模块,其中转运体、膜骨架、信号转导、受体、细胞连接、细胞粘附和代谢酶类蛋白所占比例最高,分别为18、15、14、11、10、9和6%。这与人胎肝细胞质膜的结构和生理功能密切相关。另外,在人胎肝细胞质膜上鉴定了一些已报道在细胞质膜上有定位但常见于其它亚细胞结构的蛋白,如细胞质蛋白HSP27和HSP70;内质网蛋白GRP和PDI;线粒体蛋白VDAC-1、HSP60和ATP合成酶;细胞核蛋白Lasp-1,hRNP和组蛋白。这些蛋白质可能参与新的细胞质膜上的生理活动。 鉴于在提取人胎肝细胞质膜时不可避免地存在其它内膜系统的污染,对于鉴定的非已知细胞质膜蛋白,我们不能确定是发生真正的定位变化而存在于细胞质膜还是其它亚细胞结构的污染。正常人红细胞只由胞浆和细胞膜构成,因而红细胞膜不会有其它亚细胞结构的污染。所以我们选用正常人红细胞膜作为模式细胞膜进一步对其蛋白质组进行分析。通过与研究人胎肝细胞质膜相同的两条技术策略从正常人红细胞膜上鉴定了112个非冗余蛋白质。其中整合膜蛋白64个,占总蛋白的55%,功能未知蛋白16个。这些蛋白质主要集中于膜骨架、转运体、膜运输、血型系统(细胞粘附)和代谢酶几种功能类别。糖基化修饰蛋白占鉴定蛋白的24%,且88.5%是整合膜蛋白。让人感到意外的是在鉴定的112个蛋白质中,ras超家族蛋白占10%,包括2个rap蛋白,9个rab蛋白,它们可能参与红细胞膜的特殊生理活动。此外,在红细胞膜上鉴定到一些其它亚细胞结构的蛋白质,包括参与氧化还原、脂类代谢、糖酵解、蛋白运输和蛋白降解等生理功能蛋白和组蛋白。由于红细胞膜不会有其它亚细胞结构的污染,我们认为这些蛋白质在红细胞膜上定位的可能性非常大。此点得到来自人胎肝细胞质膜蛋白质组研究的部分支持,提示这些蛋白的细胞质膜定位可能具有普遍意义。另外,在蛋白类别上红细胞膜和人胎肝具有相似之处,即两者的转运体、膜骨架和代谢酶蛋白比例比较高,但也有特殊之处,人胎肝细胞质膜上的受体与信号转导类分子和细胞连接类蛋白更多,这可能与人胎肝处于旺盛的造血和发育分化时期有关;红细胞膜上则血型蛋白和膜运输蛋白所占比例比较高。 为进一步了解人红细胞膜上这些蛋白质之间的联系,全景式地发掘红细胞膜上的蛋白质复合体,我们采用蓝色非变性胶(blue-nativegel)、SDS-PAGE、反相色谱和串联质谱分析红细胞膜上的复合体,分离到3条可见带,分子量高的两条带主要是由膜骨架和带3蛋白构成的已知复合体,从稍低分子量带鉴定的蛋白质主要包括血型蛋白、3种关键糖酵解酶(3-磷酸甘油醛脱氢酶、醛缩酶A和醛缩酶C)、葡萄糖转运体1、CD47、stomatin、带3蛋白和个别骨架蛋白。并用western-blot从BN胶上第3条带中检测出3-磷酸甘油醛脱氢酶和磷酸果糖激酶。据此我们推测:1)糖酵解酶以复合体形式存在于红细胞质膜上,它能进一步和葡萄糖转运体形成更大的复合体;2)红细胞膜上已知的几大复合体并非独立存在,而是相互联系,可能构成更大的代谢相关的超复合体。此推测具有重要的学术意义,但尚需进一步的实验验证。 总之,利用SDS-PAGE和“shotgun'”策略分析人胎肝细胞质膜和人红细胞膜的蛋白质组,发现两者的蛋白质分布既具有细胞膜共有的特性,也具有与各自的生理活动相对应的特点。揭示了一些其它亚细胞结构蛋白可能具有细胞质膜定位的普遍现象。利用全景式发掘蛋白质复合体的方法,发现糖酵解酶在红细胞膜上可形成复合体,并与葡萄糖转运体1进一步形成大的复合体;红细胞膜上蛋白质复合体并非单独存在,相互作用构成与代谢相关的超复合体。这些对进一步认识细胞膜的生理功能具有十分重要的意义。
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