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丙型肝炎病毒NS3蛋白酶及抑制肽研究
中文名称: 丙型肝炎病毒NS3蛋白酶及抑制肽研究
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论文编号: 3045777收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Study on Hepatitis C Virus NS3 Serine Protease and Its Peptide Inhibitors
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 生物化学与分子生物学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 丙型 肝炎病毒 蛋白酶 丙型肝炎病毒 酵母表达 噬菌体表面展示技术 蛋白酶多肽抑制剂
简介目录: 点击此处 免费索取本论文简介和目录>>
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论文简介:丙型肝炎是人类最常见的慢性传染性疾病之一,丙型肝炎病毒(HCV)是丙型肝炎的致病原。目前还没有有效地预防和根治此病的方法。HCVNS3是病毒基因组编码的非结构蛋白,具有多种功能。其氨基端的NS3蛋白酶(1-180aa)是有效抑制病毒复制的重要靶点。本研究利用蛋白重组技术和噬菌体表面展示技术,设计表达和筛选具有抑制HCVNS3蛋白酶活性的抑制多肽,为特异性抗HCV的多肽药物研究奠定基础。 方法:⒈用原核表达载体pQE-30分别构建含有NS3蛋白酶基因的pQE/NS3和含有单链NS3/4A基因的pQE/NS3/4A重组质粒;用重组质粒转化大肠杆菌M15,化学诱导表达目的蛋白并采用离子交换层析纯化蛋白。⒉用酵母转化载体pPICZαA,构建含有NS3蛋白酶基因克隆的pPICZαA/NS3和含有单链NS3/4A克隆的pPICZαA/NS3/4A重组质粒;用重组质粒电转化酵母GS115,甲醇诱导表达并分级沉淀纯化NS3蛋白酶。⒊利用高效原核表达载体pBVIL1和基因合成的方法,构建蛋白酶催化底物NS5A-B重组表达质粒pBVIL1/NS5A-B,转化大肠杆菌HB101,热诱导表达目的蛋白,采用离子交换层析的方法纯化蛋白;在体外用融合NS5A-B蛋白底物建立蛋白酶催化系统,并用SDS-PAGE、ELISA等方法对蛋白酶活性进行测定。⒋根据蛋白酶底物特异性,设计合成底物竞争性抑制肽基因,并构建原核重组表达载体pBVIL1/H9,表达、纯化底物竞争性抑制肽;在体外用SDS-PAGE鉴定抑制活性。⒌利用噬菌体表面展示技术,筛选具有抑制活性的NS3蛋白酶抑制肽,并在体外系统鉴定抑制活性。 结果:⒈测序结果证实,构建的原核表达载体pQE/NS3和pQE/NS3/4A正确,目的蛋白以包涵体形式高效表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定表达蛋白正确,经过离子交换层析得到电泳纯的目的蛋白。⒉含转化子的重组酵母,PCR扩增产物连接到T载体,测序结果显示转化酵母中整合有正确的目的基因序列,甲醇诱导表达后从培养上清中获得了可溶性目的蛋白酶,Westernblot鉴定证实了目的蛋白的存在,分级饱和硫酸铵沉淀得到了较纯的目的蛋白。⒊克隆到高效表达载体pBVIL/NS5A-B上的底物基因,测序正确,热诱导高效表达了包涵体形式的目的蛋白,离子交换层析纯化获得高纯度的融合蛋白NS5A-B。在蛋白酶底物NS5A-B和蛋白酶组成的反应体系中,用SDS-PAGE和ELISA法均证明,原核表达的NS3蛋白酶不存在生物活性,而酵母表达的可溶性蛋白酶虽然表达量低,但有较高的生物活性。⒋根据蛋白酶特异性底物序列设计的多位点竞争性抑制多肽,在高效表达载体pBVIL/H9上获得表达,离子交换层析纯化的H9抑制多肽,在体外对NS3蛋白酶有抑制作用。⒌用活性蛋白酶作为靶蛋白,从随机七肽库和十二肽库中经过三轮生物淘洗,筛选到具有一定蛋白酶抑制活性的6条特异性多肽,序列分析显示这些结合肽中均含有碱性氨基酸核心序列。 结论:本实验成功地在酵母表达系统中表达了可溶性的HCVNS3蛋白酶,利用原核系统融合表达了蛋白酶底物NS5A-B,并在体外系统中鉴定了蛋白酶活性。用蛋白酶底物NS5A-B,初步构建了体外HCV蛋白酶ELISA测定方法。利用蛋白酶底物的结构特点,首次设计并原核表达了具有蛋白酶抑制活性的多位点竞争性抑制多肽。从随机七肽和十二肽库中筛选到6条具有蛋白酶抑制活性的多肽,这些抑制肽结构序列中存在一个以组氨酸或精氨酸为中心的碱性氨基酸核心。
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