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NF-kappa B和AP-1在非小细胞肺癌中的表达及其意义的研究
中文名称: NF-kappa B和AP-1在非小细胞肺癌中的表达及其意义的研究
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论文编号: 3044654收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Research of Expression of NF-kappaB and AP-1 and Their Significance in Non-Small Cell Lung Cancer
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 外科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 细胞 肺癌 非小细胞肺癌 NF-kappa B c-jun/AP-1 cyclinD1 caspase3
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论文简介:在非小细胞肺癌中,NF-kappaB和AP-1的作用并不明确,该文研究了NF-kappaB和c-jun/AP-1在非小细胞肺癌中的表达,并进一步研究了二者与凋亡和增生的相关蛋白cyclinD1和caspase3关系。分析两种转录因子在非小细胞肺癌中是否有协同作用,力争为肺癌的诊治提供新的靶基因。同时,用Tunel的方法检测了NF-kappaB不同表达的肺癌细胞凋亡率的不同,进一步明确NF-kappaB在非小细胞肺癌发生发展中的作用。 材料和方法: 1.材料 2003年9月-2004年1月选取哈尔滨医科大学附属第三医院胸外科45例非小细胞肺癌(Non-SmallCellLungCancer,NSCLC)手术患者,其中男性34例,女性11例,年龄32岁~70岁。肿瘤均为单发,手术中切取部分肿瘤组织及同侧远离肿瘤的正常肺组织,立即放入液氮中,然后转入-70℃冰箱中保存。 2.方法 2.1 Westernblot:分别裂解正常肺组织和癌组织,加入RIPAbuffer,冰上孵育。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。按每个电泳孔道加入50ug蛋白混合样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜。先后加入一抗(兔抗人,NF-kappaB,c-jun,cyclinD1和caspase3的一抗均为SantaCruz公司分装产品,稀释度为1:500)和二抗(羊抗兔,SantaCruz公司产品,稀释度为1:5000)与进行杂交。行ECL反应,暗室内显影,曝光。Bandleader软件分析各电泳条带的蛋白量与β-actin蛋白含量的比值,计算相对量。 2.2 RT-PCR:切取少量癌组织及正常肺组织,TRIZOL试剂提取总RNA,取2ug,加入oligodT、反转录酶及dNTP等行反转录。反转录产物加入引物: cyclinD1(351bp):上游引物:5’GCGAGGAACAGAAGTGCG3’下游引物5’TTCACGGGCTCCAGCGACA3’caspase3(425bp):上游引物:5’GGGTGCTATFGTGAGGCG3’下游引物5’CGCCTCACAATAGCACCC3’β-actin(540bp):上游引物:5’GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA3’下游引物5’CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC3’行PCR扩增,扩增产物行琼脂糖凝胶电泳,自动成像系统照相,Bandlead软件分析各条带mRNA含量与β-actinmRNA含量的比值,计算相对量。 2.3 Tunel法检测细胞凋亡。切取5um厚的冰冻组织切片,依次加入4%多聚甲醛及0.3%H2O2甲醛,加入0.1%Triton-X100,滴加Tunel反应混合液,加入POD及DAB混合液,封片,光镜下观察结果。结果判定:以细胞内出现黄色或棕黄色颗粒为标准,(-)<20%;(+)20%-40%;(++)40-60%;(+++)>60%。(+)以上定义为阳性表达。 2.4 统计分析均数比较采用t检验,NF-kappaB和c-jun/AP-1的相关性采用双变量相关分析。不同NF-kappaB表达的肺癌细胞凋亡率的比较采用卡方检验。 实验结果: 1.Westernblot显示NF-kappaB在肺癌组织中(n=45)的表达量为0.6047±0.3572,在正常组织中(n=45)的表达量为0.2798±0.1192,二者相比有明显差异(P<0.01),c-jun/AP-1在肺癌组织中(n=45)的表达量为0.6709±0.4210,在正常组织中(n=45)的表达量为0.3051±0.1128,二者相比有明显差异(P<0.01);两种转录因子在肺癌中的表达均明显增高。 2.在NF-kappaB较高表达的肺癌组织中(n=27,表达量高于均值),cyclinD1的含量为0.6216±0.3589,caspase3的表达量为0.1314±0.0502,在NF-kappaB较低表达的肺癌组织中,cyclinD1的表达量为0.2614±0.1004,caspase3的表达量为0.2452±0.1085,cyclinD1在NF-kappaB较高表达的肺癌组织中表达量较高(P<0.01),而caspase3在NF-kappaB较高表达的肺癌组织中表达量较低(P<0.01)。在c-jun/AP-1较高表达的肺癌组织中(n=24),western分析显示cyclinD1的表达量为0.6190±0.3465,caspase3的表达量为0.1300±0.0667,在c-jun/AP-1较低表达的肺癌组织中,cyclinD1的表达量为0.2720±0.0928,caspase3的表达量为0.2497±0.1123,cyclinD1在c-jun/AP-1较高表达的肺癌组织中表达量较高(P<0.01),而caspase3在c-jun/AP-1较高表达的肺癌组织中表达量较低(P<0.01)。 3.RT-PCR显示,在NF-kappaB较高表达的肺癌组织中,cyclinD1的mRNA表达量为1.0112±0.0643,caspase3的mRNA表达量为0.4529±0.1396,在NF-kappaB较低表达的肺癌组织中,cyclinD1的mRNA表达量为0.6657±0.2496,caspase3的mRNA表达量为1.0226±0.3589,cyclinD1的mRNA在NF-kappaB较高表达的肺癌组织中表达量较高(P<0.01),而caspase3的mRNA在NF-kappaB较高表达的肺癌组织中表达量较低(P<0.01)。在c-jun/AP-1较高表达的肺癌组织中,cyclinD1的mRNA表达量为0.9942±0.2467,caspase3的mRNA表达量为0.5527±0.2004,在c-jun/AP-1较低表达的肺癌组织中,cyclinD1的mRNA表达量为0.7227±0.2668,caspase3的mRNA表达量为0.8917±0.3124,cyclinD1的mRNA在c-jun/AP-1较高表达的肺癌组织中含量较高(P<0.01),而caspase3的mRNA在c-jun/AP-1较高表达的肺癌组织中含量较低(P<0.01)。 4.将NF-kappaB和c-jun/AP-1在非小细胞中的表达进行相关性分析,显示二者有明显的相关性(P<0.01),相关系数为0.800。 5.在NF-kappaB较高表达的肺癌中,细胞凋亡率为44.4%,在NF-kappaB较低表达的肺癌中,细胞凋亡率为77.8%,NF-kappaB较低表达的肺癌细胞凋亡率较高(P=0.022)。 结论: 1.NF-kappaB和c-jun/AP-1在非小细胞肺癌中高表达。 2.cyclinD1在NF-kappaB较高表达的肺癌组织中表达量较高,表明在非小细胞肺癌中,NF-kappaB促进cyclinD1的表达。 3.caspase3在NF-kappaB较高表达的肺癌组织中表达量较低,表明在非小细胞肺癌中NF-kappaB抑制caspase3的表达。 4.cyclinD1在c-jun/AP-1较高表达的肺癌组织中表达量较高,表明c-jun/AP-1在非小细胞肺癌中促进cyclinD1的表达。 5.caspase3在c-jun/AP-1较高表达的肺癌组织中表达量较低,表明在非小细胞肺癌中,c-jun/AP-1抑制caspase3的表达。 6.NF-kappaB和c-jun/AP-1二者明显相关,两种转录因子存在着相互作用。 7.NF-kappaB在非小细胞肺癌中抑制细胞凋亡。
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