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外周血DC在控制和传播HIV感染中的作用研究
中文名称: 外周血DC在控制和传播HIV感染中的作用研究
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论文编号: 3044651收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Study on the Effect of Circulating DC on the Control and Transmission of HIV in Chinese HIV/AIDS Patients
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 皮肤病与性病学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 传播 HIV 感染 树突状细胞 M-嗜性HIV T-嗜性HIV DC-SIGN 人类免疫缺陷病毒
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论文简介:树突状细胞(dendriticcells,DC)是人体免疫系统中功能最强的一种抗原提呈细胞,在先天性免疫和获得性免疫过程中均有重要作用。人血中DC主要分为CD123+DC和CD11c+DC二个亚群。最近研究发现,在HIV感染中,DC在抑制HIV复制和清除HIV的过程中可能发挥重要作用,但DC也可能参与HIV病毒在机体内播散,目前DC在HIV传播中的作用与机制尚不明确。DC-SIGN(DC-SIGN)是一类C-型凝集素受体,只在DC上表达,能与初始T细胞表面的细胞粘附分子-3(ICAM-3)特异性结合,DC-SIGN在HIV病毒传播中是否发挥作用呢?国外目前有关DC与HIV关系的研究较少,尚无定论,而且主要集中在经性途径感染人群。我国HIV感染者的免疫特性和感染途径均不同于国外,DC在中国人群HIV感染中作用尚未见报导。本课题通过对中国HIV感染者不同感染阶段DC数量和功能的变化以及DC在HIV传播中的作用进行研究,探讨中国HIV/AIDS患者不同亚群DC绝对计数与HIV-1感染及疾病进展的关系,不同成熟状态的DC在传播HIV-1中的作用以及与HIV感染的关系。 主要方法1.研究对象:由辽宁省疾病预防与控制中心、吉林省疾病预防与控制中心以及中国医科大学艾滋病研究所艾滋病确认实验室经WB试验确认为阳性的HIV/AIDS患者。所有标本均在未接受抗病毒治疗前采集。根据HIV/AIDS患者CD4+T细胞数量和感染时间进行分组。CD4+T细胞数量大于或等于414个/μl,未经抗HIV治疗,无艾滋病特征性症状,感染时间超过10年者为HIV感染疾病长期不进展者(LTNP);CD4+T细胞数量小于414个/μl,大于或等于200个/μl为HIV慢性感染组;CD4+T细胞数量小于200个/μl为艾滋病组。健康对照来自体检门诊和实验室工作人员,抗HIV抗体阴性、血液系统及肝肾功能检查结果正常,无免疫系统疾病史的健康人,性别、年龄均与研究对象匹配。 2.T淋巴细胞绝对值计数:将20μlCD4/CD8/CD3TriTEST试剂加入TruCOUNT管中,加入50μl抗凝血,室温避光15min,加入免洗溶血素450μl,室温避光15min,用FACSMULTISET软件检测并进行自动分析、计算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值及相应比值等。 3.CD123+DCs绝对值计数:将20μlLin1-FITC、10μlCD123-PE及10μlHLA-DR-PerCP试剂加入TruCount管中,加入100μl抗凝全血,室温避光15min,加入免洗溶血素900μl,室温避光15min,应用FACSCalibur流式细胞仪检测20万个细胞,CELLQUEST软件分析。 4.流式细胞仪分析:用三色荧光标记法流式细胞技术测定的激发光为氩离子激光488nm谱线,获取阈值设在FL-3上以去除大部分HLA-DR-PerCP阴性细胞(图5)。以前向散射角(FSC)及侧向散射角(SSC)的淋巴细胞和单核细胞群为门1(R1),以表达HLA-DR-PerCP的细胞群为门2(R2),再以R1×R2为门,通过分析Lin1-FITC-/CD123-咒+细胞群(R3)分别得出所获取CD123+DCs数。通过分析门4(R4)得出所获取的荧光beads数13。根据BD公司试剂说明书按如下公式计算出CD123+DCs绝对值(个/μl)。CD123+DCs(个/μl)=获取CD123+DCs细胞数/获取beads数×内参标准珠beads数/100 5.病毒载量测定:采用全自动病毒载量测定仪(美国,Roche公司,CO-BAS)以RT-PCR方法测定,按操作说明书进行。结果用HIV-1RNA拷贝/ml表示,最低检测范围是400拷贝/ml。统计分析时,低于检测范围的结果视为400拷贝/ml。 6.病毒株TCID50检测:HIV病毒株分别是本实验室分离培养的2株M嗜性分离株、2株T嗜性分离株。提取健康人PBMC,PHA刺激3天,用RP-MI-1640(含100UIL-2)重悬,调整浓度为4×106/ml,放入37℃温箱中待用。在96孔板中部选12孔,每孔加入180ulRPMI-1640,PBMC50μl。每孔加入200μl病毒(10倍稀释),在板上做10倍系列稀释。3天后换液,第七天测p24,计算TCID50。 7.CD4+T细胞、CD14+单核细胞的分选:用密度梯度离心法提取5例正常人PBMC。采用德国Miltenyi公司的MACS免疫磁珠分选装置,严格按照说明书进行操作。 结果1.中国HIV/AIDS患者CD123+DCs数量明显减少,LTNP组CD123+DCs高于HIV慢性感染组、AIDS组,甚至高于正常对照:56例HIV/AIDS患者CD123+DCs绝对值为5.42(3.33个/μl(0.06-13.92个/μl),显著低于正常对照组7.84个/μl(3.45-13.97个/μl)(P<0.01)。 22例LTNP的CD123+DCs绝对值为9.95个/μl(6.16-20.88个/μl),显著高于HIV/AIDS患者、HIV慢性感染组及AIDS组,甚至显著高于正常对照组(7.84个/μl,3.45-13.97个/μl)(P<0.01)。其中有2例LT-NP的CD123+DCs绝对值分别为18.32和20.88个/μl。与CD123+DCs绝对值不同的是,LTNP组CD4+T淋巴细胞绝对值为820个/μl(520-1945个/μl),与正常对照组相比无显著性差异(835个/μl,605-1632个/μl)(P>0.05)。 17例HIV慢性感染者CD123+DCs绝对值为5.27个/μl(2.25-9.80个/μl),显著低于正常对照组(7.84个/μl,3.45-13.97个/μl)(P<0.01)。HIV慢性感染组CD4+T淋巴细胞绝对值为325个/μl(238-368个/μl),显著低于正常对照组(P<0.01)。 AIDS组CD123+DCs绝对值为3.31个/μl(0.31-6.46个/μl),显著低于正常对照组、HIV慢性感染组及LTNP组(P<0.01)。 2.中国HIV/AIDS患者CD123+DCs数量与疾病进展明显相关:56例HIV/AIDS患者CD123+DCs绝对值随着CD4+T淋巴细胞绝对值及百分率的升高而升高,经Spearman秩相关分析得出,其与CD4+T淋巴细胞绝对值和百分率均呈明显正相关(r=0.422,P<0.01;r=0.488,P<0.01)。检测不同疾病进展阶段的HIV感染者,我们发现LTNP组CD123+DCs数量显著增加,HIV-1RNA病毒载量水平较低(3230拷贝/ml,<400-9840拷贝/ml);AIDS组CD123+DCs数量显著降低,HIV-1RNA病毒载量水平较高(24886拷贝/ml)(P<0.01)。经Spearman秩相关分析得出,56例HIV/AIDS患者CD123+DCs绝对值与HIV-1RNA病毒载量呈显著负相关(r=-0.444,P<0.05)。 3.体外培养树突状细胞的纯度及成熟状态:5例健康人CD14+单核细胞的纯度均>95%,加入GM-CSF和IL-4培养7天后,CD14表达水平明显降低,不表达CD80、CD86,提示CD14+单核细胞已经分化为未成熟DC,加入TNF-α继续培养3天后,CD80、CD86与HLA-DR表达量明显增加,提示未成熟DC已分化为成熟DC。 4.DC成熟状态与不同嗜性HIV感染的关系:受T-嗜性HIV攻击后,未成熟DC及成熟DC培养上清p24抗原含量随培养时间延长无明显增加。受M-嗜性HIV攻击后,未成熟DC培养上清p24抗原含量随培养时间延长明显增加,成熟DC培养上清p24抗原含量不随培养时间延长明显增加。 5.未成熟和成熟DC在M-嗜性HIV-1传播中的作用:受M-嗜性HIV刺激未成熟DC与CD4+T细胞共培养后,随着培养时间延长,上清中p24含量逐渐增加,明显高于未加入CD4+T细胞的对照组。 6.未成熟和成熟DC在T-嗜性HIV-1传播中的作用:受T-嗜性HIV刺激未成熟DC与CD4+T细胞共培养后,随着培养时间延长,上清中p24含量逐渐增加,与未加入CD4+T细胞的对照组相比无显著性差异。 7.抗DC-SIGN抗体在HIV-1感染中的作用:用低浓度M-嗜性病毒株预刺激imDC、mDC、CD4+T细胞后分别与CD4+T细胞(5×105)共培养,imDC和mDC培养上清检测到大量的p24抗原,对照组CD4+T细胞培养上清p24含量无明显变化。 结论1.中国HIV/AIDS患者CD123+DC数量减少,且随疾病进展逐渐下降。外周血CD123+DC在控制HIV感染方面有重要作用,与艾滋病进展明显相关。 2.中国人LTNP外周血CD123.+DC数量显著高于HIV慢性感染者及AIDS患者,甚至高于正常对照,提示CD123+DC对LTNP疾病进程有保护性作用。 3.中国T-嗜性HIV不能在中国未成熟DC和成熟DC内复制,M-嗜性HIV能在未成熟DC内复制但不能在成熟DC内复制,提示HIV能否在DC内复制与HIV嗜性和DC成熟状态有关。 4.抗DC-SIGN抗体对HIV-1体外感染活化CD4+T细胞具有抑制作用,提示DC-SIGN在DC向T细胞传播HIV过程中可能发挥重要作用。
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