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非伤害性取样在无尾两栖类保护遗传学研究中的应用
作者:王 宇 乔宁宁 邵 晨 徐珍珍  时间:2010/3/15 15:23:00  来源:论文天下论文网

  论文关键词:非伤害性取样  无尾两栖类  保护遗传学  聚合酶链反应

  论文摘要:为了改变传统的将两栖类动物处死后再从肌肉提取 DNA的取样方法,采用非伤害性取样方法分别采集了虎纹蛙的血液和趾提取 DNA,并与从其肌肉中提取的DNA进行了比较,结果显示:使用血液和趾提取的DNA产量与肌肉样本的 DNA产量相当;随后,分别对3种方法取样的样本进行了线粒体 16S rRNA和核 DNA的微卫星 PCR分析,结果表明:3种取样方法所获得的扩增效果相当,均能满足虎纹蛙的保护遗传学研究.因此认为,用非伤害性取样技术替代传统的肌肉取样的方法在无尾两栖类的保护遗传学研究中是切实可行的。

  保护遗传学与分子生态学的研究已经成为现代生物学研究的热点,作为研究基础的 DNA,其质量的好坏成为影响实验结果的一个至关重要的因素.DNA的获得通常采用的取样方法有 3种:伤害性取样(Destructive sampling)、非伤害性取样(Nondestructive sampling)和非损伤性取样(Non-invasive sampling)….伤害性取样是指通过获得研究对象的新鲜肌肉、肝脏或者脾等组织提取DNA.这种取样方式对于物种的破坏极大,特别是对于珍稀濒危物种而言,它的破坏力是毁灭性的因此,许多研究者已经放弃了这种取样方法.非损伤性取样则是在不触及或不伤害野生动物本身的前提下,通过收集脱落的毛发或羽毛、粪便、尿液、食物残渣(含有口腔脱落细胞)、鹿角、鱼鳞和卵壳等不同形式的样品进行遗传分析的一种取样方法.该方法的一个很大的特点是采样不会对动物本身产生伤害,但却很难收集到完整的DNA,目前该方法比较多地应用于大型兽类和鸟类的研究中.非伤害性取样则是通过抽取动物的血液、采集毛发或羽毛、耳、尾或趾等来用以分析无尾两栖类作为生态系统中的一个重要组成部分,在农田生态系统、水域生态系统以及森林生态系统中都起到非常重要的作用.然而,由于生境的丧失、外来种的入侵、过度的捕猎、紫外光的作用、化学物质的影响H 和疾病,以及全球气候的变化,使得无尾两栖类的种群急剧减少因此,对无尾两栖类的保护迫在眉睫.目前国内对于无尾两栖类的遗传结构、线粒体序列以及遗传多样性等方面的研究仍然采用伤害性取样方法.采用非伤害性取样甚至是非损伤性取样策略在无尾两栖类的研究中势在必行.基于此,本文采用非伤害性取样方法从无尾两栖类的血液、脚趾提取 DNA样本,探讨了非伤害性取样技术在无尾两栖类保护遗传学研究中的应用。

  1 材料与方法

  1.1 实验动物及其处理

  以采 自浙江金华的虎纹蛙 (Hoplobatrachurugulosus)3只作为实验材料.使用注射器对每一个体的活体从心脏抽取血液,同时剪下不同的趾作为标记,然后处死,并剪下腿部肌肉作为实验的对照样本.采集到的血样使用酸性柠檬酸葡萄糖溶液 B(ACD)以体积比5:1混合抗凝,剪下的趾用95%乙醇液浸泡,所有的样本均置于 一70℃超低温冰箱保存.

  1.2 方法

  1.2.1  DNA的提取

  根据文献[10]的方法略作改动,具体如下:血液样本:在常温下解冻含有抗凝剂的血液样本,取 100 IxL于离心管中,加入250 txL抽提缓冲液 (0.01 mol/L的 Tris-HC1(pH 8.0),0.mol/L的乙二胺 四乙酸二钠 (EDTA,pH 8.0)5 g/L十二烷基硫酸钠 ),离心(5 000 r/min,10rain),去上清液,在沉淀物中加人 100 IxL抽提缓冲液和5 L蛋白酶 K溶液(pK),37℃水浴 4 h.趾样本:取 0.1 g 95%乙醇液浸泡的趾组织使用双蒸水反复冲洗掉表面的乙醇并剪碎,加入500 L抽提缓冲液和5 L pK,55℃水浴4 h,离心(9 000 r/min,10 min)后取上清液. 肌肉样本:常温下解冻肌肉样本,取 0.1 g肌肉组织剪碎于离心管中,加入 500 IxL抽提缓冲液和5 L pK,55℃水浴4 h,离心(9 000 r/min,10rain)后取上清液.

  在上述处理过的样本中加入等体积的饱和苯酚溶液,混匀(500 r/rain,15 rain),离心(9 000r/min,15 min),取上清液;之后,加入等体积的氯仿-异戊醇(体积比24:1),混匀(500 r/min,15min),离心(9 000 r/min,15 min),取上清液并加入 2.5倍体积的预冷的无水乙醇,置于 一20℃冰箱沉淀 DNA 2 h或以上;弃上清液后用70%乙醇液洗涤 DNA,真空干燥,加入 100 L TE(0.01moVL Tris—HC1,0.1 mol/L EDTA)溶解 DNA,于一20℃保存.

  1.2.2 DNA的检测

  选择线粒体 16S rRNA和核 DNA的微卫星位点引物 Hrug 01进行 PCR扩增反应,以检验 DNA在遗传分析中的可用性.PCR反应体系为 25 含2 mmoL/L或 1.5 mmo~L MgC12,0.15 mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷,0.06 mmo~L引物,0.75 UTaq聚合酶,模板 DNA 50 ng,10 mmoVL TrisHCI,50 mmoVL KC1,双蒸水补足到 25  L.反应条件为:95℃预变性4 min;95  变性30 s,55 oC或50℃退火 30 s,72℃延伸 40 s,循环 35次;72℃再延伸 10 min.扩增产物在溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶中电泳,紫外灯下观察电泳结果.

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[本文关键字] 无尾两栖类 保护遗传学 聚合酶链反应
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